遺伝子活性化基質を用いた硬組織再生に関する研究

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13470429
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 朝比奈 泉 東京大学, 医科学研究所, 寄付研究部門教員(常勤形態) (30221039)
• 研究分担者: 本田 雅紀 東京大学, 医科学研究所, 寄付研究部門教員(常勤形態) (70361623) ; 丸岡 豊 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (10323726) ; 春日井 昇平 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (70161049)
• キーワード: 遺伝子活性化基質 / リン酸カルシウム / 骨形成たんぱく質 / 遺伝子治療 / 再生医療

研究概要

昨年までの本研究で、遺伝子活性化基質の基質としてコラーゲンを用いた場合、遺伝子導入効率が非常に低いことがわかった。そこで、われわれはリン酸カルシウム(CaP)の小粒子が負電荷のプラスミドDNAに親和性が高いことを利用し、プラスミドDNAとコラーゲンにCaPの小粒子を組み合わせることにより、生体内で遺伝子導入効率を増加できる方法の開発を試みた。
1)カルシウムリン酸の微粒子の使用が遺伝子導入効率に及ぼす影響
EGFP発現プラスミドベクターをコラーゲンあるいはCaPと混合し、ラットの皮下に移植、2週後にペレット埋入部組織の蛍光強度を測定したところ、CaPとコラーゲンの組み合わせはコラーゲン単独の移植に比べて遺伝子導入効率が10倍程度向上していた。また、ペレットをPBS中で振盪し、DNAの溶出を調べたところ、CaPを加えることによって、DNAの溶出は5分の1程度に減少した。さらに、pEGFPをCaPと結合させDNAseを作用させた後に電気泳動を行うとDNAが検出でき、CaPを加えることによりプラスミドDNAがDNAaseに対する抵抗性を増すことがわかった。
2)CaPとコラーゲンを組み合わせたBMP2遺伝子導入による骨組織の再生
BMP2を発現するプラスミドコンストラクトを作製し、8週齢のラット脛骨に形成した5mmの骨欠損に、pBMP2、コラーゲン、CaPを組み合わせて移植した。6週後にラットを屠殺し、移植部位を観察したところ、pBMP2、コラーゲン、CaPを組み合わせたもので全例骨組織の再生を認めた。コラーゲンとpBMP2を移植したものの報告に較べ1/100量の10μgのプラスミドDNAで充分に骨欠損部の再生が可能であった。
3)ポリグリコール酸(PGLA)を用いた遺伝子活性化基質の検討
動物由来材料であるコラーゲンに代わり、有機化合物であるポリグリコール酸を用いた検討を行ったところ、PGLAがコラーゲンに代わりうることを見いだした。

研究成果

• [文献書誌] Hosoya M, Maruoka Y, Oda M, Asahina I, Ichinose S, Omura K: "Bone with a Vascular Flap Induced from Fat Tissue with the Use of rhBMP-2 in Rats."J Dent.Res. 82(8). 581-584 (2003)
• [文献書誌] Kabasawa Y, Asahina I, Gunji A, Omura K: "Administration of Parathyroid Hormone, Prostaglandin E_2,or 1-alpha,25 Dihydroxyvitamin D_3 Restores the Bone Inductive Activity of rhBMP-2 in Aged Rats."DNA and Cell Biol.. 22(9). 541-546 (2003)
• [文献書誌] Alam MI, Asahina I, Seto I, Oda M, Enomoto S.: "Prefabrication of vascularized bone flap induced by recombinant human bone morphogenetic protein 2(rhBMP-2)."Int.J.Oral Maxillofac.Surg.. 32(5). 508-514 (2003)
• [文献書誌] Yoneda S, Itoh D, Kuroda S, Kondo H, Umezawa A, Ohya K, Ohyama T, Kasugai S.: "The effects of enamel matrix derivative (EMD) on osteoblastic cells in culture and bone regeneration in a rat skull defect."J Periodontal Res.. 38(3). 333-342 (2003)
• [文献書誌] Duarte WR, Shibata T, Takenaga K, Takahashi E, Kubota K, Ohya K: "S100A4: a novel negative regulator of mineralization and osteoblast differentiation."J Bone Miner Res.2003 Mar. 18(3). 493-501 (2003)
• [文献書誌] Asahina I, Marukawa E, Seto I: "Reconstruction of the non-human primate mandible using bone morphogenetic protein (BMP) in 5^<th> Asian Conference Oral and Maxillofacial Surgery"Monduzzi Editore, Bologna, Italy. 165 (2003)