| 研究概要 |
1.Phosphodiesterase(PDE)3Bノックアウトマウスでの検討
海外共同研究者である米国国立衛生研究所のVincent C. Manganiello主任らが作成したPDE3Bノックアウト,および,ワイルドタイプマウスの比較を行ったが,特に体重や大きさに変化は認めなかった.次に,それぞれより下顎骨等を摘出した.光学顕微鏡標本作製のため固定後,脱灰し,パラフィン包埋を行った.また,電子顕微鏡標本作製のため固定後,脱灰し,樹脂包埋を行った.
2.PDE8遺伝子導入
平成13年度の研究でマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞MC3T3E1でPDE3,PDE4,およびPDE8の発現を認めPDE8の阻害剤が石灰化の抑制と骨マーカー遺伝子発現を変化させたことよりPDE8遺伝子導入を計画した.PDE8遺伝子導入等の研究は報告されていなかったため,MC3T3E1細胞のPDE8遺伝子の変化を確認するため,total RNAを抽出後,cDNAを作成し,PCRにて増幅した.TAクローニングにてベクターに挿入し,大腸菌にトランスフェクションした.プラスミドを回収後,このプラスミドをテンプレートとしてシークエンスの反応を行い,シークエンサーで解析を行った.これまでに報告されていたマウスのシークエンスと同じでありこのプラスミドを発現ベクターとして用いた.
3.Antisense作製
これまでにPDE8のantisenseの報告は全くないため平成13年度に引き続きansisenseとsenseを作製した.また,antisenseの効果をウエスタンブロットで検討するためリコミナントタンパクを作成した.各骨マーカー遺伝子等(PDE8,オステオカルチン,アルカリフォスファターゼ等)の発現を検討するためプライマーを作製した.
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