|
本年は、これまでの研究によって既に確立しているELISAを用いた唾液中コチニンの定量法と同じ原理によって、唾液中のニコチンを定量する方法の確立を目指した。ELISAでニコチンを定量するためには、まず、抗ニコチン抗体が必要となるが、本研究の着手時点では市販の抗コチニン抗体を入手することが不可能であったため、初めにコチニンと反応するモノクローナル抗体の作製を試みた。3'-hydroxymethly-nicotine hemisuccinateをヘモシアニンのアミノ基に共有結合させ、生じたニコチン-ヘモシアニン結合物でBALB/cマウスを免役した。免疫後、マウスの脾臓細胞を調製し、ミエローマ細胞と融合さたハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマについてニコチンに対する抗体を産生するクローンをスクリーングした。
しかし、現段階でも良好なニコチンに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは得られておず、万一モノクローナル抗体が得られないことも想定して、他の手段で唾液中のニコチンを定量する方法の確立も平行して行うこととした。ニコチンを定量する他の方法には高速液体クロマトグラフィーを用いる方法がある。C18Sep-Pakカラムを用いてメタノール、アセトニトリル、蒸留水のグラディエントで溶出し、UV260nmで検出することで、50-1000ng/mlの範囲で直線的な定量性が得られた。ニコチンの検出感度はELISAによるコチニン定量に比較するとかなり劣り、改善の余地は残るが、現段階でも高いレベルの喫煙を調べるには十分な感度と考えられる。次年度は、抗ニコチン抗体の作製状況に応じて、HPLCによるニコチン定量も考慮に入れて、喫煙者の唾液中のニコチンとコチニン量の定量と歯周疾患の有病状況の関係を調べる疫学調査を計画している。
|
