化学発光測定システムを用いた薬剤性肝障害の検出と解毒機構の解明

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13470476
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 堀江 利治 千葉大学, 大学院・薬学研究院, 教授 (90120154)
• 研究分担者: 伊藤 晃成 千葉大学, 大学院・薬学研究院, 助手 (30323405) ; 桝渕 泰宏 千葉大学, 大学院・薬学研究院, 助教授 (10209455)
• キーワード: 化学発光 / グルタチオン / 酸化的ストレス / MRP2 / 4-ヒドロキシノネナール / 活性酸素 / 肝障害 / 肝細胞

研究概要

肝臓は薬物、代謝物、あるいは老廃物を体外に排出してはじめてその解毒機能を完了する。これまでに我々は、ナプロキセンなどの薬物による肝内酸化的ストレスの発生により胆汁流量が顕著に減少することを観察している。胆汁流の低下に伴う胆汁鬱滞は肝機能を損傷し肝疾患に繋がる。胆汁流は胆汁酸依存性と非依存性胆汁流から構成され、前者はBile Salt Export Pump(BSEP)、後者はMultidrug Resistance-associated Protein2(MRP2)が関与する。これらを背景として、本研究では酸化的ストレスに起因する肝障害ならびに胆汁鬱滞の機構を解明することを目的としている。
酸化的ストレスにより肝で生成する毒性物質4-ヒドロキシノネナール(HNE)は主にグルタチオン抱合体(HNE-SG)に代謝される。このHNE-SGの胆汁中排泄におけるMultidrug Resistance-associated Protein2(MRP2)の関与を明らかにするために、これまで高感度で検出できる方法がなかったHNE-SGの非放射ラベルHPLC定量法を開発した。HNE-SGには複数の光学異性体が存在するので、光学異性体分離カラムを用い、また当研究室ですでに利用しているo-フタルアルデヒドを用いたグルタチオンの分離法(ポストラベル法)を組み合わせた定量法である。本法により、4種類のHNE-SG立体異性体を分離し、定量限界10pmolで検出可能となった。MRP2欠損ラット(Eisaihyperbilirubinemia rat,EHBR)および正常ラットにHNEを投与し、胆汁中へのHNE-SGの排泄を測定したところ、EHBRではHNE-SGの胆汁中への排泄は認められず、HNE-SGの胆汁排泄にMRP2が関与することが示唆された。さらに、MRP2遺伝子導入細胞を用いてコントロール細胞と比較検討したところ、HNE-SGの胆汁排泄にMRP2が寄与率ほぼ100%で関与することが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Doi H., Iwasaki H., Masubuchi Y., Nishigaki R., Horie T.: "Chemiluminescence associated with the oxidative metabolism of salicylic acid in rat liver microsomes"Chemico-Biological Interactions. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] Yamamoto K., Masubuchi Y., Narimatsu S., Kobayashi S., Horie T.: "Toxicity of ethacrynic acid in isolated rat hepatocytes"Toxicology In Vitro. (印刷中).
• [文献書誌] Ji B., Masubuchi Y., Horie T.: "A possible mechanism of naproxen-induced lipid peroxidation in rat liver microsomes"Pharmacology & Toxicology. 89・1. 43-48 (2001)
• [文献書誌] Yamamot K., Masubuchi Y., Narimatsu S., Kobayashi S., Horie T.: "Rat liver microsomal lipid peroxidation produced during oxidative metabolism of ethacrynic acid"Pharmacology & Toxicology. 88・4. 176-180 (2001)