| 研究概要 |
小胞体内で生合成された蛋白質は、ゴルジ体に運ばれ選別が行われる。この選別を行うのがcargo receptorであり、小胞体とゴルジ体間ではERGIC-53が、ゴルジ体と細胞膜間ではVIP36がそれぞれその役割を演じている。この2つのレセプターは植物マメ科レクチンと相同のドメインを持ち、糖蛋白質の糖鎖を認識してその選別を行っている。今回、両レセプターの糖結合特異性改変を行うために、レクチンドメインを他の特異性を持つマメ科レクチンと置換したキメラ分子を作成した。特異性は本来のマンノースからガラクトースあるいはシアル酸に変化するようにキメラ分子を構築した。キメラcDNAをpRC-CMVベクターに組み込み、MDCK細胞で発現させた。これらの強制過剰発現させた細胞株では、細胞表面に輸送される膜タンパク質の糖鎖構造が変化していることが、種々のレクチン染色により明らかになった。これらの細胞内での発現の局在性は、mycタグあるいはHisタグに対する抗体を用いた免疫染色によって調べたが、細胞内だけでなく細胞表面にもかなり存在しており、細胞内に関してはより詳細な検討が必要である。一方、特異性をランダムに改変したERGIC-53あるいはVIP36のライブラリーの作成も試みた。マメ科レクチンのループ1は糖結合特性を規定する糖結合ポケットの壁を作っていることから、ERGIC-53, VIP36のループ1に相当する部位にランダムな変異を導入したライブラリーをPCR法を用いて作成した。ランダムな部位は合成オリゴヌクレオチドを直接用いることで偏りを最小限になるように配慮した。ライブラリー数は、それぞれ2×105および6×105であった。今後、これらのライブラリーを発現させた細胞株のライブラリーを作成し、種々の糖に特異的な抗体やレクチンなどのプローブを用いて選別を行う予定である。
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