mRNAの品質管理システム(mRNAサーベイランス)の分子機序:ヒトSMG1の構造と機能の解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13480211
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 大野 茂男 横浜市立大学, 医学部, 教授 (10142027)
• 研究分担者: 秋本 和憲 横浜市立大学, 医学部, 助手 (70285104) ; 平井 秀一 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (80228759)
• キーワード: ナンセンス変異 / mRNA分離 / mRNAサーベイランス / p53 / プロテインキナーゼ / リン脂質キナーゼ / RNAヘリカーゼ / ATPアーゼ

研究概要

遺伝子変異の1/4程度はナンセンス変異である。ナンセンス変異はトランケート型のタンパク質をコードするが、実際にはこのようなタンパク質が検出されない。これはナンセンス変異を有するmRNAが選択的に分解されていることに起因する。この現象は、nonsense mediated mRNA decay, NMDと呼ばれ、修復を逃れた遺伝子変異に由来する異常タンパク質に起因する毒性から細胞を守る、細胞の防御機構の一つである。近年、このNMDという現象やその分子機構の解析が始まっているが、そのほとんどは酵母、線虫の変異体の解析に留まっており、特に高等生物におけるその生理的意義や医学・生命科学への応用性これに関わるトランス因子(タンパク質)や制御の仕組みは全く不明である。私たちはmRNAサーベイランスに、SMG-1を介したUPF1のリン酸化が必須である事を発見すると同時に、その阻害剤を見いだした。また、HSMG-1阻害剤を用いてmRNAサーベイランスを特異的に抑制し、トランケート型タンパク質を発現することに成功している。更にその生理的基質タンパク質UPF1を同定し、リン酸化部位を決定した。
本研究では、これを押し進め、NMDの分子機構をタンパク質リン酸化の観点から解析することを目的とした。その結果、線虫のSMG-5ヒトホモログの解析を通じて、UPF1のPP2Aによる脱リン酸化がmRNAサーベイランスに必須であることを発見した。さらにこの過程で、サーベイランス複合体を「フリーズ」させる変異体を発見した。また、この変異体を用いて、脱リン酸化反応もmRNAサーベイランスに必須であることを証明した。一方、UPF1のリン酸化と脱リン酸化がサーべーランス複合体の構成要素を変化させる事を発見した。
上述のタンパク質群及びそれに対する抗体、さらにSMG-1によるリン酸化部位を認識する抗体などを用いて、SMG-5,SMG-7のほとんどが細胞内で結合していること。これらが、リン酸化されたUPF1に選択的に結合していることを見いだした。つまり、これらがサーベイランス複合体の構成員であることを示した。また、UPF1やSMG-5の変異体の中で、mRNAサーベイランスを抑制するものを選択し、これを用いて、サーベイランス複合体の構成員を免疫沈降、免疫吸収により解析し、それがUPF1のリン酸化に応じて大きく変化することを見いだした。mRNAサーベイランスの分子機構に関するこれまでの私たちの研究成果を総合すると、hSMG-1によるhUPF1のリン酸化、引き続くPP2AによるhUPF1の脱リン酸化の過程がmRNAの必須の過程であること、この過程で、サーベイランス複合体の組成(そしておそらく性質)が大きく変化することを発見したことになる。

研究成果

• [文献書誌] Baba, M., Hirai, S-f., Yamada-Okabe, H., Hamada, K., Tabuchi, H., Kobayashi, K., Kondo, K., Yoshida, M., Yamashita, A., Kishida, T., Nakaigawa, N., Nagashima, Y., Kubota, Y., Yao, M., Ohno, S.: "Loss of von Hippel-Lindau protein causes cell density-dependent deregulation of CyclinD1 expression through Hypoxia-inducible factor"Oncogene. (in press).
• [文献書誌] Kitamura, K., Mizuno, K., Etoh, A., Akita, Y., Miyamoto, A., Nakayama, K-I, Ohno, S.: "The second phase activation of protein kinase Cd at late G1 is required for DNA synthesis in serum-induced cell cycleprogression"Genes to Cells. (in press).
• [文献書誌] Suzuki, A., Akimoto, K., Ohno, S.: "Protein Kinase Cl/i (PKCl/i) : A PKC isotype essential for the development of multicellular organisms"Japanese Biochemical Society. 133. 9-16 (2003)
• [文献書誌] Nagai-Tamai, Y., Mizuno, K., Hirose, T., Suzuki, A., Ohno, S: "Regulated protein-protein interaction between aPKC and PAR-3 plays an essential role in the polarization of epithelial cells"Genes to Cells. 7. 1161-1171 (2002)
• [文献書誌] Yamaji, S., Suzuki, A., Kanamori, H., Mishima, W., Takabayashi, M., Fujimaki, K., Tomita, N., Fujisawa, S., Ohno, S., Ishigatsubo, Y: "ILK-affixin complex is involved in integrin-cytoskeleton linkage in platelets"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 297. 1324-1331 (2002)
• [文献書誌] Ohno, S., Nishizuka, Y.: "Protein kinase C isotypes and their specific functions : prologue"J. Biochem. (Tokyo). 132. 509-511 (2002)
• [文献書誌] Suzuki, A., Ishiyama, C., Hashiba, K., Shimizu, M., Ebnet, K., Takai, Y., Ohno, S: "aPKC kinase activity is required for the asymmetric differentiation of the premature junctional complex during epithelial cell polarization"J. Cell Science. 115. 3565-3573 (2002)
• [文献書誌] Manabe, N., Hirai, S-I., Imai, F., Nakanishi, H., Takai, Y., Ohno, S: "Association of ASIP/mPAR-3 with adherens junctions of mouse neuroepithelial cells"Developmental Dynamics. 225. 61-69 (2002)
• [文献書誌] Hirai, S-I., Kawaguchi, A., Hirasawa, R., Baba, M., Ohnishi, T., Ohno, S.: "UK) regulates the radial migration of immature neurons in"Development. 129. 4483-4495 (2002)
• [文献書誌] Tsuru, M., Katagiri, H., Asano, T., Yamada, T., Ohno, S., Ogihara, T., Oka Y.: "Role of PKC isoforms in glucose transport in 3T3-L1 adipocytes : insignificance of atypical PKC"Am J Physiol Endocrinol Metab. 283. E338-E345 (2002)
• [文献書誌] Mishima, A., Suzuki, A., Enaka, M., Hirose, T., Mizuno, K., Ohnishi, T., Mohri, H., Ishigatsubo, Y., Ohno, S.: "Over-expression of PAR-3 suppresses contact-mediated inhibition of cell migration in MDCK cells"Genes to Cells. 7. 581-596 (2002)
• [文献書誌] Hirose, T., Izumi, Y., Nagashima, Y., Tamai-Nagai, Y., Kurihara, H., Sakai, T., Suzuki, Y., Yamanaka, T., Suzuki, A., Mizuno, K., Ohno, S.: "Involvement of ASIP/PAR-3 in the promotion of epithelial tight junction formation"J. Cell Science. 115. 2485-2495 (2002)
• [文献書誌] Miyamoto, A., Nakayama, K., Imaki, H., Hirose, S., Jiang, Y., Abe, M., Tsukiyama, T., Nagahama, H., Ohno, S., Hatakeyama, S., Nakayama, K-I.: "Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta"Nature. 416. 865-869 (2002)
• [文献書誌] Hiwasa, T., Nakata, M., Nakata, M., Ohno, S., Maki, M., Suzuki, K., Takiguchi, M.: "Regulation of transformed state by Calpastatin via PKCepsilon in NIH3T3 mouse fibroblasts"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 290. 510-517 (2002)
• [文献書誌] 山下暁朗, 大西哲生, 大野茂男: "mRNAサーベイランス"蛋白質・核酸・酵素版. 47(2). 101-112 (2002)