雄性生殖細胞を卵子化する技術の開発

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13480279
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 畑田 出穂 群馬大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (50212147)
• 研究分担者: 尾畑 やよい 群馬大学, 遺伝子実験施設, 助手 (70312907)
• キーワード: インプリンティング / メチル化 / 核移植 / 生殖細胞 / 卵子

研究概要

Igf2rは卵子形成過程で特異的にメチル化されるインプリント遺伝子である。しかし、卵子形成過程〓期にメチル化されるのか、詳細な報告はない。そこで、Sodium Bisulfite法によりIgf2r遺伝子イントロ〓あるCpGアイランドの30CpGサイトについて、経時的にメチル化型解析を行った。その結果、胎齢〓胎仔より採取した始原生殖細胞では、30CpGサイト全てが脱メチル化されていたが、生後日の幼齢マ〓採取した成長期卵子では、直径40-50μmのもので約25%程度(5-7CpGサイト)がメチル化され〓-60μmのものでは約80%程度(20-30CpGサイト)がメチル化されていることが明らかとなった。〓ウスより採取した直径80μmの卵子では、30CpGサイト全てがメチル化されていることが確認され〓ことから、Igf2r遺伝子は、卵子の成長に伴い領域全体が徐々にメチル化されていくことが明らかとな〓稿中)。また、生後10日の幼齢マウスより採取した直径50μm前後の成長期卵子をレシピエント卵と〓生殖細胞を融合させた場合に、卵子型のメチル化を書き込める可能性が強くし示唆された。
一方、成長期卵子に雄性生殖細胞を融合させた場合、卵子型のメチル化を書きこむために一定期〓培養が必要と考えられる。しかし、卵子の成長に不可欠とされる顆粒膜細胞や卵胞膜細胞は核移植作〓化される。そこで、裸化卵子の成長培養法を開発することにした。顆粒膜細胞と卵胞膜細胞をfeeder〓て、透明帯を除去した直径38μm未満の卵子を接着培養したところ、培養7日目に直径45μmまで成〓これらの卵子のメチル化型をHap II(メチル基感受性制限酵素)-PCR法により簡易的に解析した結果〓日目には、少なくとも一部のCpGサイトがメチル化されることが明らかとなった。このことから、裸〓接着培養は、卵子特異的なメチル化型を確立するのに十分な培養法であること示された。
現在、核移植と核移植卵の培養を検討しはじめたところである。

研究成果

• [文献書誌] Sotomaru Y., Katsuzawa Y., Hatada I., Obata Y., Sasaki H., Kono T.: "Unregulated expression of the imprinted genes H19 and Igf2r in mouse uniparetal fetuses"J Biol Chem. (in press). (2002)
• [文献書誌] Hatada I., Morita S., Obata Y., Sotomaru Y., Shimoda M., Kono T.: "Identification of a new imprinted gene, rian, on mouse chromosome 12 by fluorescent differential display screening"J Biochem. 130. 187-190 (2001)
• [文献書誌] Gregory RI., Randall TE., Johnson CA., Khosla S., Hatada I., O'Neill LP., Turner BM., Feil R.: "DNA methylation is linked to deacetylation of histone H3, but not H4, on the imprinted genes Snrpn and U2af1-rs1"Mol Cell Biol. 21. 5426-5436 (2001)
• [文献書誌] Sotomaru Y., Kawase Y., Ueda T., Obata Y., Suzuki H., Domeki I., Hatada I., Kono T.: "Disruption of imprinted expression of U2afbp-rs/U2af1-rs1 gene in mouse parthenogenetic fetuses"J Biol Chem. 27. 26694-26698 (2001)