DNA逆位反応を利用した不揮発性メモリー素子によるバイオセンサーの開発

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13554033
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 沓掛 和弘 岡山大学, 理学部, 教授 (90143362)
• 研究分担者: 原山 重明 (株)海洋バイオテクノロジー研究所, 釜石研究所, 所長 ; 大西 浩平 高知大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (50211800) ; 冨永 晃 岡山大学, 理学部, 助手 (60155570)
• キーワード: 逆位DNA / メモリー素子 / バイオセンサー / 鞭毛相変異 / Hセグメント / 転写スイッチ / アラビノースセンサー

研究概要

1.不揮発性メモリー素子の設計:本研究で開発する予定のバイオセンサーは、3つの要素からなる。第1の要素は特定物質の検出素子であり、これには転写調節蛋白質を用いる。第2の要素は検出情報を蓄える記憶素子であり、これにはDNAの逆位反応を利用する。第3の要素は、不揮発性メモリーの状態によって発現の有無が決定されるレポーター遺伝子である。第1の要素(検出素子)が特定の物質との結合した場合、これによって第2の要素(逆位DNA)の逆位反応を触媒する酵素(DNA逆位酵素)の遺伝子が発現されるようになるシステムを作成する。逆位DNAとしてサルモネラ鞭毛相変異を制御するHセグメント、R64プラスミドのシャフロン、酵母の2μDNAのFlpを利用する系をそれぞれ設計した。
2.モデル実験系の確立:本年度はレポーター系として、鞭毛相変異を利用したシステムを構築した。使用した大腸菌株EKK15はfliC遺伝子に欠損をもち、染色体上の別の座位にサルモネラのfljB遺伝子をもつ。この株はDNA逆位酵素の遺伝子を完全に欠き、fljBプロモーターを含むHセグメントはfljB非発現の向きに固定されている。したがって、本菌株は遊走性を示さない。この株内でDNA逆位酵素を発現させれば、Hセグメントの逆位にともなって、遊走性のある細菌が産生されることになる。発現ベクターpTrc99とpBAD30を用いて、DNA逆位酵素の遺伝子がIPTGやアラビノースによって誘導されるシステムを構築した。前者は非誘導条件下でもDNA逆位酵素がかなり発現されたので不適だった。後者はかなりタイトな制御が可能であったので、EKK15株に移入してアラビノースセンサーを構築し、モデル実験系とした。

研究成果

• [文献書誌] Tomoyasu, T.: "The ClpXP ATP-dependent protease regulates flagellum synthesis in Salmonella enterica serovar Typhimurium"Journal of Bacteriology. 184. 645-653 (2002)
• [文献書誌] Uemura, T.: "Sensing of cytoplasmic pH by bacterial chemoreceptors involves the linker region that connects the membrane-spanning and the signal-modulating helices"Journal of Biological Chemistry. 277. 1593-1598 (2002)
• [文献書誌] Kikuchi, M.: "DNA shuffling and family shuffling for in vitro gene evolution"Methods in Molecular Biology. 182. 243-257 (2002)
• [文献書誌] Tominaga, A.: "characterization of cryptic flagellin genes in Shigellaboydii and Shigella dy senteriae"Genes & Genetic Systems. 76. 111-120 (2001)
• [文献書誌] Kasai, Y.: "The TOL plasmid pWWO xylN gene product from Pseudomonas putida is involved in m-xylene uptake"Journal of Bacteriology. 183. 6663-6666 (2001)
• [文献書誌] Futamata, H.: "Group-specific monitoring of phenol hydroxylase genes for a functional assessment of phenol-stimulated trichloroethylene bioremediation"Applied and Environmental Microbiology. 67. 4671-4677 (2001)