ウイルス吸着タンパク質を用いた下水処理水からの病原ウイルス除去技術の実用化

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13555145
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 大村 達夫 東北大学, 大学院・工学研究科, 教授 (30111248)
• 研究分担者: 渡部 徹 東北大学, 大学院・工学研究科, 助手 (10302192) ; 栗原 和枝 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (50252250)
• キーワード: ウイルス吸着タンパク質(Virus-Binding Protein : VBP) / 下水処理水 / 病原ウイルス / 配向固定化 / アミノシラン / ポリリジンタグ / グルタルアルデヒド / ELISA

研究概要

病原ウイルスに対する吸着親和性の高いタンパク質(ウイルス吸着タンパク質:Virus-Binding Protein, VBP)を活性汚泥中から分離し,このVBPを用いた下水処理水からの病原ウイルス除去技術を実用化することが本研究の目的であった.平成13年度には,活性汚泥細菌からポリオウイルス1型(PV1)に対するVBPをアフィニティクロマトグラフィにより分離することに成功し,さらに平成14年度には,活性汚泥からのVBP遺伝子分離およびVBPクローニングシステムの構築に成功した.本年度はVBP固定化技術開発及びPV1吸着実験を行い,以下に述べる成果を得た.
まず,担体として用いるガラスビーズ表面上へのVBP固定化手法を構築した.硫酸酸性過酸化水素水(Piranha溶液)でよく洗浄したガラスビーズ表面上をアミノシラン(3-アミノプロピルトリエトキシシラン)で修飾し.さらにグルタルアルデヒドを導入した.その次にVBPを導入することで,VBP間の架橋を防ぎつつ,ガラスビーズ表面からVBPまでを共有結合で強固に結合することが可能である.本手法により,VBPがガラス粒子表面上に確かに導入されたことをELSIAによって確認した.
さらに,ガラス粒子表面上におけるVBPの配向固定化を実現するため,VBPのC末端にポリリジンタグを導入したLysTag-VBPの合成を試みた.ポリリジンタグ導入用のプライマーを設計し,PCR反応によりLysTag-VBP遺伝子を創出した.このLysTag-VBP遺伝子を組み込んだプラスミドpRSETを大腸菌に導入して培養したところ,LysTag-VBPを効率的に合成することに成功した.上述の固定化手法を用いてガラスビーズ表面上にLysTag-VBPを固定化し,固定化されたLysTag-VBPを用いてポリオウイルス1型吸着実験を行ったところ,固定化Lystag-VBPとポリオウイルス1型間の結合が親和性の高いものであることが確認され,本技術を利用した水中病原ウイルス除去技術が実現可能であることが示された.

研究成果

• [文献書誌] T.Suzuki, Y-W.Zhang, T.Koyama, D.Y.Sasaki, K.Kurihara: "Direct Observation of Specific Interaction between Enzyme-Substrate Complexes Using Colloidal Probe Atomic Force Microscopy"Chemistry Letters. (in press). (2004)
• [文献書誌] Daisuke Sano, Takahiro Matsuo, Tatsuo Omura: "Virus-binding proteins recovered from bacterial culture derived from activated sludge by the affinity chromatography using a viral capsid peptide"Applied and Environmental Microbiology. (in press). (2004)
• [文献書誌] Daisuke Sano, Kensuke Fukushi, Yasuko Yoshida, Tatsuo Omura: "Detection of enteric viruses in municipal sewage sludge by a combination of the enzymatic virus elution method and RT-PCR"Water Research. 37・14. 3490-3498 (2003)
• [文献書誌] Taro Antsuki, Daisuke Sano, Tatsuo Omura: "Functional metal-binding proteins by metal-stimulated bacteria for the development of an innovative metal removal technology"Water Science and Technology. 47・10. 109-115 (2003)
• [文献書誌] K.Kurihara, Y.Nakagawa, M.Mizukami: "Hydrogen-bonded Macrocluster Formation of Ethylene Glycol on Silica Surfaces in Ethylene Glycol-Cyclohexane Binary Liquids"Chemistry Letters. 32・1. 84-85 (2003)
• [文献書誌] M.Mizukami, K.Kurihara: "Hydrogen-Bonded Macrocluster Formation of 1-Propanol and 2-Pronanol on Silica Surfaces"Aust.J.Chem. 56. 1071-1080 (2003)