| 研究概要 |
Rhodococcus菌由来のタンパク質誘導発現系(ニトリラーゼ系)が既に取得されているが、本系を利用した場合、イソバレロニトリルを誘導剤として培地に添加することによって、ニトリラーゼ(ニトリルを酸とアンモニアに分解する酵素)が大量に生成する。
本研究では、ニトリラーゼ遺伝子プロモーター,ニトリラーゼ構造遺伝子,転写活性化タンパク質遺伝子から構成される本ニトリラーゼ系に対して、切り縮め実験を行った。すなわち、上流域や下流域などを様々に欠失させた断片をそれぞれ構築した。続いて、構築した数種の切り縮め断片を大腸菌で複製するベクターに連結し、得られたプラスミドをそれぞれ大腸菌に導入し、大腸菌内での発現を検討した。しかし、高速液体クロマトグラフィーによるアッセイの結果、ニトリラーゼ活性が検出できなかったことから、Rhodococcus菌由来のタンパク質誘導発現系は大腸菌内では機能しないことが判明した。
次に、構築した数種の切り縮め断片を放線菌で複製するプラスミドに連結し、それぞれを導入し、放線菌において発現するかを確認した。形質転換放線菌において可溶性画分にニトリラーゼが確認できたことより、Rhodococcus菌由来の遺伝子が放線菌の転写・翻訳系で認識され、放線菌内で発現し、機能することが初めて明らかとなった。
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