好冷細菌ゲノムの全塩基配列解読と低温適応に関与する遺伝子の解析、好冷酵素の開発

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13556014
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 教授 (50135597)
• 研究分担者: 山下 裕兄 タカラバイオ株式会社, プロジェクトマネージャー ; 三原 久明 京都大学, 化学研究所, 助手 (30324693) ; 栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 助手 (70243087)
• キーワード: 好冷細菌 / ゲノム解析 / 低温適応 / 好冷酵素 / 形質転換 / 宿主-ベクター系 / Shewanella sp.Ac10 / Acinetobacter sp.strain no.6

研究概要

1.南極海水から単離した好冷細菌Shewanella sp.Ac10の全ゲノム解析を行った。ゲノムサイズは4.5Mbp、ORF数は約4800であった。
2.Shewanella sp.Ac10を4℃と18℃で培養し、菌体内タンパク質を二次元電気泳動で比較した結果、iron-regulated protein Aと相同性を示すタンパク質が、4℃で特異的に生産されることを見いだした。本タンパク質の遺伝子上流にはプロモーターと推定される配列が2カ所存在した。これらをβ-ラクタマーゼ遺伝子上流に接続し、ベクターに挿入してShewanella sp.Ac10に導入した結果、菌体はアンピシリン耐性を示した。これらの配列はプロモーターとしての機能を有し、Shewanella sp.Ac10を宿主とした外来タンパク質生産システムの構築に利用できることが示された。
3.シベリア土壌から単離した好冷細菌Acinetobacter sp.strain no.6の遺伝子ライブラリーを、Escherichia coli C600を宿主として構築し、トリブチリンを含む寒天培地でのハロ形成を指標としてスクリーニングした結果、3種の脂質分解酵素遺伝子を単離することができた。この内の一つは、amidase signature familyに属し、種々のエステルを加水分解する活性を示した。別の一つはβ-ケトアジピン酸エノールラクトンヒドロラーゼと相同性を示し、種々のビニルエステルを低温で効率よく加水分解する活性を示した。
4.β-ラクタマーゼ遺伝子をレポーターとするAcinetobacter sp.strain no.6用のプロモータープローブベクターを構築した。スクリーニングを行い、プロモーターを含む164bpの遺伝子断片を取得した。

研究成果

• [文献書誌] Suzuki, Takeshi et al.: "A cold-active esterase with a substrate preference for vinyl esters from a psychrotroph, Acinetobacter sp.strain no.6: gene cloning, purification, and characterization"J.Mol.Catal.B : Enzym.. 16. 255-263 (2002)
• [文献書誌] Suzuki, Takeshi et al.: "Primary structure and catalytic properties of a cold-active esterase from a psychrotroph, Acinetobacter sp.strain no.6, isolated from Siberian soil"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 66・8. 1682-1690 (2002)
• [文献書誌] Wei, Yun-lin et al.: "A novel esterase from a psychrotrophic bacterium, Acinetobacter sp.strain no.6, that belongs to the amidase signature family"J.Mol.Catal.B : Enzym.. (In press). (2003)