逆遺伝学的手法による新型狂犬病経口ワクチンの開発

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13556054
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 源 宣之 岐阜大学, 農学部, 教授 (10144007)
• 研究分担者: フランク ルーリック 共立製薬株式会社, 中央研究所, 課長(研究職) ; 杉山 誠 岐阜大学, 農学部, 助教授 (80196774)
• キーワード: 狂犬病ウイルス / リバース・ジェネッテクス / 新型ワクチン / 遺伝子補強 / 遺伝子配置換え / 半生 / 免疫原

研究概要

本研究の目的は、最近我々が確立した狂犬病ウイルスのリバースジェネテックス(逆遺伝学)の手法を用いて、これまでにない高い免疫原性と安全な画期的な狂犬病不活化経口ワクチン製造株の創世に係わる基礎情報の確立と、それに基づいたワクチンの実用化を目指したものである。研究の1〜2年間で、わが国の現行動物用ワクチン株の病原制御アミノ酸領域を特定した(Microbiol.Immunol.,2001;J.Virol.,2001;J.Neurovirol.,2004)。また、細胞に感染してウイルス構造蛋白質を合成するが子孫ウイルスを産生しない、いわゆる「半生」ワクチン創世のための基礎実験を行い、従来のワクチニアウイルスを使わずに組換え狂犬病ウイルスを効率よく回収するT7RNAポリメラーゼ恒常発現細胞系(BHK/T7-9)を確立した(Microbiol.Immunol.,2003)。そこで、最終年度では、「半生」ワクチン製造用のM遺伝子欠損ウイルス株の構築と狂犬病ウイルスの5つの遺伝子のうち、免疫原性と密接な関わりのある糖(G)遺伝子を二重に加えたあるいは配置換えしたウイルスの作出を試みた。また、創世されたワクチン製造株の培養細胞での増殖性、マウスにおける免疫原性や安全性などを検討した。その結果、以下の成果が得られた。
1.BHK/T7-9細胞にM蛋白質発現プラスミドを導入し、リバースジェネテックスにより、M遺伝子欠損ウイルスを効率よく回収した。M遺伝子欠損ウイルスは現行ワクチンのRC-HL株より免疫原性および安全性の高いことが確認された(第51回日本ウイルス学会、2003)。
2.免疫原性を向上させるためにG遺伝子を二重に、あるいは3'末端側に配置換えしたウイルス(3'-G-N-P-M-G-L-5';3'-N-G-P-M-G-L-5';3'-N-P-M-G-G-L-5'など)を構築し、G蛋白質発現の増強を確認した(第137回日本獣医学会で発表予定、2004)。

研究成果

• [文献書誌] Ito, N.: "A comparison of complete genome sequences of the attenuated RC-HL strain of rabies virus used for production of animal vaccine in Japan, and the parental Nishigahara strain"Microbiology & Immunology. 45(1). 51-58 (2001)
• [文献書誌] Ito, N.: "Rescue of rabies virus from cloned cDNA and identification of the pathogenicity-related gene : glycoprotein gene is associated with the virulence for adult mice"Journal of Virology. 75(19). 9121-9128 (2001)
• [文献書誌] Sugiyama, M.: "Identification of immunodominant neutralizing epitopes on the hemagglutinin protein of rinderpest virus"Journal of Virology. 76(4). 1691-1696 (2002)
• [文献書誌] Ito, N.: "Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system"Microbiology & Immunology. 47(8). 613-617 (2003)
• [文献書誌] Susetya, H.: "Genetic characterization of rabies field isolates from Thailand"Microbiology & Immunology. 47(9). 653-659 (2003)
• [文献書誌] Sugiyama, M.: "Isothermal amplification of rabies virus gene"The Journal Veterinary Medical Science. 65(10). 1063-1068 (2003)
• [文献書誌] Ito, M.T.: "Region at amino acids 164 to 303 of the rabies virus glycoprotein plays an important role in pathogenicity for adult mice"Journal of Neurovirology. (in press). (2004)
• [文献書誌] Ito, N.: "A new rabies vaccine candidate with both of advantageous characters of attenuated live and inactivated vaccines"Journal of Virology. (in press).
• [文献書誌] 源 宣之: "獣医微生物学 第2版"文永堂. 239-244 (2003)