| 研究課題/領域番号 |
13557004
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
栗原 敏 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90057026)
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| 研究分担者 |
渡辺 美智子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (10158660)
須田 憲男 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (80201581)
田中 悦子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70256410)
井上 敏 チッソ株式会社, 横浜研究所, 次席研究員
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| キーワード | イクオリン / 遺伝子組換え / 変異イクオリン / Ca応答性 / 発光 |
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| 研究概要 |
細胞内Ca指示薬イクオリンを遺伝子組換えの手法を用いて新規組換え半合成イクオリンを創出して、細胞内Ca指示薬としての応用範囲を広め汎用の道を開くことを目的とする。これまでに以下の結果が得られた。1)組換えイクオリン及び半合成イクオリンの合成に着手した。アポイクオリン分泌発現ベクターpiP-HEを用いて、3L系での大腸菌内発現法を確立した。最終的に2LのLB培地を用いて培養菌体から、精製組換えイクオリン(純度95%以上)を約100mg精製した。この精製イクオリンを半合成イクオリン合成の原料とする予定である。また、より高純度イクオリンを作製するために、通常のLB培地の代わりに合成培地を用い、発現後、イクオリンを培地から精製する系を確立した。
2)変異イクオリン遺伝子の作製、発現、および精製を試みた。イクオリンのX線結晶解析で得られた情報をもとに、発光基質セレンテラジンペルオキシドに関するアミノ酸残基(a)チロシン-184をフェニルアラニン、チロシン(Y184F、Y169F)、(b)ヒスチジン-169をフェニルアラニン、チロシン(H164F、H169Y)へPCR法で改変を行い、塩基配列を確認後、分泌発現ベクターpiP-HE系で発現させた。4つの変異体は発光活性を持っているが、精製過程で全て失活した。粗抽出液でのY184H変異体は、野生型に比べ発光のパターンが異なり、ゆっくり発光が減衰するタイプであった。これらの結果を踏まえて、異なる部位の変異の導入を試みる。
次年度は、作製されたイクオリンのCaイオンに対する応答性を測定する。
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