2001 年度実績報告書

細胞内蛋白の特異的分解制御による癌治療法の確立 -人工受容体を有するユビキチンリガーゼの作製と応用-

研究課題

研究課題/領域番号	13557019
研究機関	九州大学
研究代表者	中山敬一九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80291508)
研究分担者	山下順範協和発酵工業(株), 東京研究所, 主任研究員中山啓子九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (60294972) 畠山鎮次九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (70294973)
キーワード	ユビキチンリガーゼ / Myc / Mad / Nedd4 / プロテアゾームインヒビター
研究概要	本研究では、ユビキチンリガーゼを人工的に改変することによって、新しい基質特異性を有するユビキチンリガーゼを創出し、生体にとって有害な分子を除去するシステムを構築することを目的とし、Mycをモデルタンパク質として用いた。 1.目的分子(Myc)は、プロテアゾームインヒビターによって細胞内に蓄積が観察されたので、実際に細胞内でユビキチン化により分解制御を受けて発現量が変化することが示唆された。 2.無細胞系においてもMycのユビキチン化を再構築するために、細胞抽出液を使用してユビキチン化反応が起こる条件を検討し、再構成実験が可能となった。 3.キメラ(標的結合ドメインとユビキチンリガーゼ)型人工ユビキチンリガーゼの開発をおこなう。実際には、分解するターゲット蛋白により、様々なタイプのユビキチンリガーゼを遺伝子融合のパートナーとして利用する予定であるが、まずはHECT型ユビキチンリガーゼであるNedd-4をパートナーとして使用した。細胞質においてMadと結合するMycの分解を促進することを期待して、Mad(Myc結合蛋白)とNedd-4(HECT型ユビキチンリガーゼ)のキメラ型人工ユビキチンリガーゼを作製した。 4.細胞内へのキメラ型人工ユビキチンリガーゼの導入と目的分子(Myc)の発現量の検討する。細胞レベルで標的蛋白のユビキチン化及び発現減少が観察されるかを、上記のキメラ型人工ユビキチンリガーゼcDNAの発現を一過性に行い、ウエスタンブロットや免疫蛍光染色により、Mycの発現量を現在検討している。 5.キメラ型人工ユビキチンリガーゼのアデノ/レトロウイルス発現系を確立するためベクターの準備は終了した。このベクターを用いてMad/Nedd-4融合蛋白が細胞分裂速度の減少もしくはダブリングタイムの増加が観察されるかの機能的レベルでの検討を行う予定である。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Hara, T.: "Degradation of p27^<Kip1> at the G0-G1 transition mediated by a Skp2-independent ubiquitination pathway"J. Biol. Chem. 276. 48937-48943 (2001)
[文献書誌] Malek, N.P.: "A mouse knock-in model exposes sequential proteolytic pathways that regulate p27^<Kip1> in G1 and S phase"Nature. 413. 323-327 (2001)
[文献書誌] Tsukiyama, T.: "Down-regulation of p27^<Kip1> expressin is required for development and function of T cells"J.Immunol. 166. 304-312 (2001)
[文献書誌] Nagahama, H.: "Spatial and temporal expression patterns of the cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors p27^<Kip1> and p57^<Kip2> during mouse development"Anat. Embryol. 203. 77-87 (2001)
[文献書誌] Minamishima, A.Y: "Recovery of liver mass without proliferation of hepatocytes after partial hepatectomy in Skp2-deficient mice"Cancer Res. 62. 995-999 (2002)
[文献書誌] Miyamoto, A.: "Increased proliferation of B cells and autoimmunity in mice lacking Protein kinase Cδ"Nature. (in press). (2002)

2001 年度 実績報告書

細胞内蛋白の特異的分解制御による癌治療法の確立 -人工受容体を有するユビキチンリガーゼの作製と応用-

研究代表者

中山 敬一 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80291508)

研究成果

[文献書誌] Hara, T.: "Degradation of p27^<Kip1> at the G0-G1 transition mediated by a Skp2-independent ubiquitination pathway"J. Biol. Chem. 276. 48937-48943 (2001)

[文献書誌] Malek, N.P.: "A mouse knock-in model exposes sequential proteolytic pathways that regulate p27^<Kip1> in G1 and S phase"Nature. 413. 323-327 (2001)

[文献書誌] Tsukiyama, T.: "Down-regulation of p27^<Kip1> expressin is required for development and function of T cells"J.Immunol. 166. 304-312 (2001)

[文献書誌] Nagahama, H.: "Spatial and temporal expression patterns of the cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors p27^<Kip1> and p57^<Kip2> during mouse development"Anat. Embryol. 203. 77-87 (2001)

[文献書誌] Minamishima, A.Y: "Recovery of liver mass without proliferation of hepatocytes after partial hepatectomy in Skp2-deficient mice"Cancer Res. 62. 995-999 (2002)

[文献書誌] Miyamoto, A.: "Increased proliferation of B cells and autoimmunity in mice lacking Protein kinase Cδ"Nature. (in press). (2002)

2001 年度実績報告書

中山敬一九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80291508)