| 研究課題/領域番号 |
13557096
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| 研究機関 | 国立佐倉病院(臨床研究部) |
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研究代表者 |
剣持 敬 国立佐倉病院, 臨床研究部, 研究員 (50215133)
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| 研究分担者 |
西郷 健一 千葉大学, 医学部附属病院, 助手 (60323424)
坂本 薫 国立佐倉病院, 臨床研究部, 室長
山田 研一 国立佐倉病院, 臨床研究部, 部長
丸山 通広 国立佐倉病院, 臨床研究部, 研究員
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| キーワード | 膵島移植 / 遺伝子導入 / リポフェクション法 / リベレース / 無血清培地 |
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| 研究概要 |
1.膵島への遺伝子導入法の確立:
小動物(ラット)、大動物(イヌ)から分離された膵島を用いて、1)Lipofection法(polyamine transfection reagents (Trans IT 100,Pan Vera, Co.,)またはLIPOFECTAMINE2000(LIFETECHNOLOGIES))、2)1)Gene gun法(Helios^<TM> Gene Gun (BIO-RAD))、3)Electroporation法(Gene-Pulser II (BIO-RAD))の3つの方法を検討した。遺伝子導入効率はpZeoSV2/lacZ vector (Invitrogen Co.)またはplasmid pCMS-EGFP (CLONTECH)を導入し、X-gal染色、蛍光顕微鏡観察にて判定した。
導入効率はLipofection法で94.7%(LIPOFECTAMINE2000)、92.2%(polyamine transfection reagents)と良好であり、Gene gun法では34.7%、Electroporation法では42.9%であった。ヒト膵島への導入は安全性、有効性よりLipofection法が推奨される。
2.純化酵素、無血清培地による安全な膵島分離、培養技術の開発:
本院では膵・膵島移植研究会ワーキンググループの事務局がおかれ、わが国における臨床膵島移植実施準備を進めている。臨床膵島移植実施また遺伝子導入膵島移植実現のためには安全性の高い分離、培養時術が必須である。今回純化酵素(リベレース)、無血清培地の有効性を検討した。イヌ膵よりリベレース用いて膵島を精製、無血清培地(1% ITS 加 CMRL1066)にて培養した。膵島収量、純度は4233IEQ/g、93%と良好であり、1日培養後のインスリン分泌能も良好であった。純化酵素と無血清培地の使用は、安全性の高い技術を提供し得る。
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