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Stable clonepR5-1細胞は前年度までの研究により得られたものであり、定常的にはpXIcol-Z(XI型コラーゲンプロモーターの直下にbeta-galactosidase遺伝子を繋いだもの)の発現がないにもかかわらず、BMPの添加により他の軟骨の分化マーカーの発現上昇が認められ、同時にlacZの発現上昇が認められるものである。そこでモニターとしてのlacZの発現が軟骨分化に伴うことをさらに確認するため、FACSにおけるsortingを、BMPの添加後に行った。lacZ活性を示す蛍光が高い画分の細胞群を回収し、活性染色したところ期待通りに活性の高い細胞群が回収できたことが確認できた。このことでStable clonepR5-1細胞は軟骨分化のモニターとして使うことのできる性質を持っている可能性が示唆された。そこで今度は軟骨分化に対して正に働く分子を単離する目的で、前年度に作製したcDNAライブラリーをウイルスを使って発現させる準備を行った。すなわち作製したplasmid cDNAライブラリーをウイルスのパッケージング細胞にトランスフェクトし細胞培養上清を回収した。ウイルスが含まれる部分を遠心分離しtiterをチェックした。作製したレトロウイルスライブラリーをclonepR5-1細胞に感染させ培養後、一定期間培養した細胞をFACS、sortingを行った。LacZ活性が高い画分の細胞をもう一度FACS、sortingかけ活性が高い細胞群を濃縮した。その細胞を薄くまくことでクローニングした。さらに得られた細胞からゲノムDNAを単離し、ウイルスが組み込まれた部分のPCRを行い、組み込まれたcDNAの同定を行った。
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