DnaAドメインIVを用いた新規抗菌剤の探索開発プロセスの研究

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13558090
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 片山 勉 九州大学, 薬学研究院, 助教授 (70264059)
• 研究分担者: 胡桃坂 仁志 理化学研究所, 細胞情報研究室, 研究員 (80300870) ; 麻生 真理子 九州大学, 薬学研究院, 助手 (30201891) ; 植田 正 九州大学, 薬学研究院, 助教授 (90184928) ; 遠藤 淳 第一製薬(株), 創薬第一研究所, 副主任研究員
• キーワード: DNA複製 / 細胞周期 / DNAポリメラーゼ / DnaAタンパク質 / ATP / AAA+ファミリー / 染色体複製制御 / 大腸菌

研究概要

多剤耐性菌の出現や、新興感染症が次々と発生するなど、新規抗菌剤への社会的需要は高い。DnaA蛋白質は細菌類に広く保存されており、染色体の複製に必須である。DnaA蛋白質(52kDa)のC末端10kDa断片に、この特異的DNA結合能が担われていて、ドメインIVと呼ばれる。DnaA機能阻害剤開発のため、本研究計画前半では、このドメインIV蛋白断片を用いて、活性スクリーニング系の開発、3次元構造解析をまず目指すことにしている。本年度は、大量生産株を作成し、このドメインのみからなる蛋白断片の精製に成功した。実際、このドメインIV蛋白には、特異的DNA結合能があることを証明した(片山)。DnaA蛋白質の3次元構造解析は未だに成功していないが、この蛋白ドメインではNMRによる立体構造解析が可能である。そこで、NMRによる構造解析を行い、DnaA domain IVの^1H,^<13>C,^<15>Nの化学シフトを同定し各アミノ酸残基の帰属も決定した。これらはすでにBMRBに登録済みである(登録番号5200)(植田)。並行して、この蛋白ドメインのX線結晶解析による構造解析を行うため結晶化した。すでに2.5解像度での放射光回折データが得られている(胡桃坂)。以上のように本計画研究においては、1年目にして、特定DNA結合能を有するDnaAドメインIV蛋白の機能解析はほぼ完遂し、構造解析による研究成果が本格的に収集できる段階に進んできている。これは当初計画時以上に速やかな研究進展に成功していることを意味している。

研究成果

• [文献書誌] Nishida, S., Fujimitsu, K., Sekimizu, K., Ohmura, T., Ueda, T., Katayama, T.: "A nucleotide switch in E.coli DnaA protein initiates the chromosomal replication : Evidence from a mutant DnaA protein defective in regulatory ATP hydrolysis in vitro and in vivo"Journal of Biological Chemistry. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] Onogi, T., Ohsumi, K., Katayama, T., Hiraga, S.: "Replication-dependent recruitment of the β subunit of DNA polymerase III from cytsolic spaces to replication forks in Escherichia coli"Journal of Bacteriology. 183(4). 867-870 (2002)
• [文献書誌] Kubota, T., Ito, Y., Sekimizu, K., Tagaya, M., Katayama, T.: "DnaA protein Lys-415is close to the ATP-binding site : ATP-pyridoxal affinity labeling"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 288(5). 1141-1148 (2001)
• [文献書誌] Kawakami, H., Iwura, T., Takata, M., Sekimizu, K., Hiraga, S., Katayama, T.: "Arrest of cell division and nucleoid partition by genetic alterations in the sliding clamp of the replicase and DnaA protein"Mol.Genet.Genomics. 266. 167-179 (2001)
• [文献書誌] Kato, J., Katayama, T.: "Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli."EMBO Journal. 20(15). 4253-4262 (2001)
• [文献書誌] Su'etsugu, M., Kawakami, H., Kurokawa, K., Kubota, T., Takata, M., Katayama, T.: "DNA replication-coupled inactivation of DnaA protein in vitro : a role for DnaA arginine-334 of the AAA^+ Box VIII motif in ATP hydrolysis"Molecular Microbiology. 40(2). 376-386 (2001)