| 研究課題/領域番号 |
13558091
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
細胞生物学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
臼倉 治郎 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (30143415)
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| 研究分担者 |
木村 政史 株式会社日立サイエンスシステムズ, 電子装置システム設計部, 主任研究技師
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| キーワード | 凍結レプリカ装置 / 電子顕微鏡 / 膜の裏打ち / フリーズエッチング / アクチン / 急速凍結 / 免疫細胞化学 / 細胞膜 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は膜と細胞骨格などの相互作用を分子レベルで形態解析できるような新しい凍結エッチング装置の開発とそれを用いた膜構造の解析であった。初年度においてまず凍結エッチング装置を作製した。この装置は真空度約1×10^<-6>Pa、温度は室温と-160℃の間で制御でき、さらに、ミクロトーム装置が内蔵されているのでガラスナイフやダイアモンドナイフにて試料を10nm以上の精度で切削できる。また電子銃も改良したためタングステンやモリブデンなど高融点金属を超高真空中で蒸着できる。従来の白金レプリカに比べ、極めて分解能が高くなった。このため、試料を必ずしも洗剤で洗い流す必要はなく、そのままで観察が可能である。したがって、洗剤による酸化などでのレプリカ膜の劣化を心配する必要がなく。白金以外のより粒子の細かい高融点金属を蒸着原として使用することが出来る。X線結晶回折と比べると劣るが、10nmぐらいの分解能で蛋白分子複合体の構造解析には有効である。平成14年度からは応用面に力を注ぎこの装置を用いて急速凍結ディープエッチ免疫レプリカ電顕法を行った。極めて容易に細胞膜の細胞質側表面を全面にわたって観察できた。細胞膜の近傍での膜骨格の形態や構造が明らかになりつつある。免疫金コロイド標識によって膜骨格は主にアクチンとスペクトリン、アデューシン、ゲルゾリンなどのアクチン結合タンパク質からなることがわかってきた。また、アクチンの枝分かれを可能にするArp2/3蛋白も同定することが出来た。クラスリン被覆ピットやカベオラと膜骨格との結合も見えはじめた。またこれらを定量的に解析するために三次元再構築を試みた。±45°の間で1°ステップで90枚の写真を撮り膜裏打ち構造のアニメーションや立体再構築に成功した。
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