細胞シート工学による培養人工角膜上皮の開発

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13558119
• 研究機関: 東京女子医科大学
• 研究代表者: 大和 雅之 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (40267117)
• 研究分担者: 篠崎 和美 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (10256521) ; 堀 貞夫 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (20143498) ; 清水 達也 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (40318100)
• キーワード: ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド) / 温度応答性表面 / 細胞シートのマニピュレーション / 角膜上皮細胞 / ディスパーゼ / 移植 / 細胞間接着 / 基底膜

研究概要

我々は、温度に応じて水との親和性を大きく変化させる温度応答性高分子を培養皿表面に共有結合的に固定化することにより温度応答性培養皿を開発した。この表面は、37℃では市販の培養皿と同程度の弱い疎水性を示し様々な細胞が接着・伸展するが、温度を32℃以下に下げると高度の親水性を示し、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を必要とすることなく細胞を脱着させることができる。コンフレントな細胞層を形成させた後に低温処理すると、全細胞を細胞-細胞間接着により連結した一枚の細胞シートとして脱着を・回収することができる。本研究では、温度応答性培養皿上で角膜上皮細胞を増殖・重層化させ、低温処理により重層角膜細胞シートとして回収し、移植可能な培養人工角膜上皮の作製技術を開発する。本年度は、臨床応用を目指した移植法の開発をおこない以下の成果を得た。(1)重層角膜上皮細胞シートの温度応答性培養皿からの回収法の最適化:角膜実質上への移植を簡便にするためにサポータを用いて回収することを検討した。様々な形状・材質のサポータを試した結果、ドーナツ状の親水化PVDF膜が最適であることを見出した。ドーナツの内径を角膜の外径とすることで、簡単に移植することができた。(2)ウサギ病態モデルを用いた移植法の開発:白色家兎の角膜上皮を輪部と共に完全除去し、2〜3週間おくことで結膜上皮が角膜実質を完全に被覆する病態モデルを作成した。結膜上皮を切除し、角膜実質を露出させた後、(1)の方法で回収した重層角膜上皮細胞シートを移植した。一切、縫合することなく数分で細胞シートが角膜実質に接着することを見出した。移植後10日で完全に角膜上皮が再生することを確認した。現在、再生角膜上皮の詳細な解析をおこなっている。

研究成果

• [文献書誌] M.Harimoto, M.Yamato, C.Takahashi, Y.Isoi, A.Kikuchi, T.Okano: "Novel approach for achieving double-layered cell co-culture : overlaying endotheliel cell sheets onto mondayer hepatocytes utilizing temperature-responsive culture dishes"J. Biomed. Mater. Res.. 62(3). 464-470 (2002)
• [文献書誌] M.Yamato, C.Konno, M.Utsumi, A.Kikuchi, T.Okano: "Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture"Biomaterials. 23. 561-567 (2002)
• [文献書誌] M.A.Nandkumar, M.Yamato, A.Kushda, C.Konno, M.Hirose, A.Kikuchi, T.Okono: "Two-dimensional cell sheet manipulation of heterotypical co-cultured lung cells utilizing temperature-responsive culture dishesresultsin long-term maintenance of differentiated epithelial cell function"Biomaterials. 23. 1121-1130 (2002)
• [文献書誌] T.Shimizu, M.Yamato, Y.Isoi, T.Akutsu, T.Setomaru, K.Abe, A.Kikuchi, M.Umezu, T.: "Fabrication of pulsatile cardic tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation technique and temperature-responsive cell culture surfaces"Circ.Res.. 59. 136-143 (2002)
• [文献書誌] T.O.Colier, J.M.Anderson, A.Kikuchi, T.Okano: "Adhesion behavior of monocyte, macrophages and foreign body giant cells on poly (N-isopropylacrylamide) temperature-responsive surfaces"J.Biomed.Mater.Res.. 59. 136-143 (2002)
• [文献書誌] T.Shimizu, M.Yamato, T.Akutsu, T.Shibata, Y.Isoi, A.Kikuchi, M.Umezu: "Electrically communicating three-dimensional cardiac tissue mimic fabricated by layered cultured cardiomyocyte sheets"J.Biomed.Mater.Res.. 60. 110-117 (2002)
• [文献書誌] M.Harimoto, M.Yamato, A.Kikuchi, T.Okano: "Tissue Engineering for Therapeutic Use 6, Y.Ikada, Y.Umakoshi, T.Hotta, Eds."Double layerd co-culture of hepatocytes and endothelial cell sheets by cell sheet engineering. 15 (2002)