タンパク質線維状重合体を用いた生体ナノゲージの開発と応用

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13559008
• 研究機関: 早稲田大学
• 研究代表者: 石渡 信一 早稲田大学, 理工学部, 教授 (10130866)
• 研究分担者: 藤田 英明 日本学術振興会, 特別研究員(PD)
• キーワード: バイオナノゲージ / アクチンフィラメント / 微少管 / 分子モーター / 心筋培養細胞 / GFP-アクチン / タンパク質腺維状重合体 / タンパク質歪みゲージ

研究概要

タンパク質線維状重合体として、アクチンフィラメントと微小管を取り上げ、これらの機能(ミオシンやキネシンなどの分子モーターの運動性への寄与)を解折するとともに、"生体ナノゲージ"として細胞生物学研究に利用することを企てている。その第一歩として、蛍光色素をラベルしたアクチン分子をアクチンフィラメントに組み込み、フィラメントの状態を蛍光画像化しモニターすることを試みている。1)蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを、ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12に導入し、その未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。まず、アクチン分子のN末端とC末端にそれぞれGFPを導入し培養心筋細胞に発現させたところ、細胞は正常に発達し、GFPアクチンはフィラメントに組み込まれた(共焦点蛍光顕微鏡により観察)。つぎに、アクチン分子を2つの部分に分割し、そこに、前後を入れ替えたGFPを導入した。こうすることによってGFPの構造を不安定化し、アクチン分子に加わる力によって生じる分子歪みに応じてGFPの蛍光性が変化することを期待した。これまで、分割する場所を2箇所検討したが、両方ともに大量発現させると、細胞は正常には発達しないことが分かった。現在、別の部位へのGFPの導入や、変異アクチンの発現量の制御、別タイプのGFP導入アクチンの調製を行っている。2)アクチン分子のCys374を蛍光ラベルし、これをフィラメントに導入することによってフィラメントの状態をモニターすることを試みた。ローダミンを導入するとミオシン分子モーターの運動性(運動速度、ATPase活性)が導入率に応じて減少することを見出した。今後は、フィラメントに負荷を加えることによる蛍光強度や蛍光スペクトルの変化、モーター機能への影響を、1本のフィラメントのレベルで検討したい。

研究成果

• [文献書誌] Kawaguchi, K, Ishiwata, S: "Thermal activation of single Kinesin molecules with temperature pulse microscopy"Cell Mohl. Cyfoskel. 49. 41-47 (2001)
• [文献書誌] 岡野和宣: "DNAプローブアレイを用いたDNA断片回収"電気学会論文誌. 121E. 181-186 (2001)
• [文献書誌] Fukuda, N. et al.: "Acidosis and inorganic phosphate enhance length dependence of fusion generation in skinned rat cardiac muscle"J. physiol. 104. 1639-1645 (2001)
• [文献書誌] Fukuda, N. et al.: "Length dependence of fonsion generation in rat skinned cardiac muscle, Role of fifin with Frank-Starling mechanism of the heart"Circulation. 104. 1639-1645 (2001)
• [文献書誌] Fujita, N. et al.: "Elementary steps of the cross-bridge cycle in bovine myocardium with and without regulatory proteins"Biophys, J.. 82. 915-928 (2002)
• [文献書誌] Uemura, S. et al.: "Kinesin-minotubule binding is dependent on both nucleotide state and loading direction"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (in press). (2002)