| 研究課題/領域番号 |
13640683
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
渡部 省二 山口大学, 医学部, 教授 (30113020)
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| 研究分担者 |
長谷川 宏幸 帝京科学大学, 理工学部, 教授 (10092983)
山本 芳実 山口大学, 農学部, 助教授 (40115514)
高橋 進 山口大学, 農学部, 教授 (90022665)
山城 安啓 山口大学, 医学部, 助手 (50243671)
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| キーワード | ATP依存性プロテアーゼ / ミトコンドリア / タンパク分解 / 副腎皮質 / チオレドキシン / 活性酸素 |
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| 研究概要 |
本年度はまず準備段階として、ウシ副腎皮質細胞の培養をおこなった。当初の予定では米国ATCCよりウシ副腎皮質培養細胞株SBAC細胞を購入する予定であったが、この細胞がウィルスに感染していることがわかったので、確立された細胞株ではなく初代培養細胞を用いることとした。ウシ副腎皮質をトリプシンおよびコラゲナーゼで処理し、4代まで継代し、ステロイドホルモンの産生能を確認し、また、ステロイドホルモン合成の最初のステップでの酵素(チトクロームP450scc)の存在を抗体染色で確認した。ほとんどの細胞でチトクロームP450sccの存在が認められ、線維芽細胞の混入は10%以下であった。一方、ATP依存性プロテアーゼを副腎皮質細胞で過剰発現させるためにプロテアーゼのcDNAをRT-PCRにより増幅した。翻訳領域が長い(2883塩基対)ので二つの部分に分けて増幅した。これを適当な制限酵素で切断、結合させ、発現ベクターに結合させた。これを大腸菌を用いてクローニング、塩基配列を決定し、アミノ酸の置換がおこっていないクローンを選んだ。この発現ベクターはインデューサーを加えることによってクローン化遺伝子の発現を誘導することができるベクターで、このくクローン化した遺伝子を副腎皮質にトランスフェクトし、インデューサーを加えたところ、期待通り分子量11万くらいのタンパク質が合成された。
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