Anammox反応を触媒する酵素系の解明

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13650861
• 研究機関: 崇城大学
• 研究代表者: 藤井 隆夫 崇城大学, 工学部, 教授 (80165331)
• 研究分担者: 杉野 浩幸 崇城大学, 工学部, 講師 (90258434) ; 古川 憲治 熊本大学, 工学部, 教授 (60029296)
• キーワード: 嫌気的アンモニア酸化 / Anammox / hao / 窒素処理 / 脱窒

研究概要

我々は熊本市の地下水から嫌気的アンモニア酸化(Anammox)活性を有する細菌の集積培養に成功し、活性を持つバイオフィルムを調製している。本反応を行っている細菌は現在まで世界的にも純化できていないため、初めにバイオフィルム中の菌相解析を行った。バイオフィルムからDNAを抽出し、バクテリアの16S rRNA遺伝子を増幅した。増幅したDNAの塩基配列から新規のplanctomycete、Zoogloea属細菌が主要な菌として確認した。とくにplanctomyceteは、系統発生学的に最初にAnammox活性を有する細菌と報告されたCandidatus Brocadia anammoxidansと相同性が高く、Anammox反応を触媒している細菌と思われ、KSU-1と仮称することにした。リアルタイムPCRによる上記菌株の定量的解析を行ったところ、全バクテリアの大部分をKSU-1とZoogloea sp.が占めていた。また、これらの16S rRNA配列をもとに蛍光オリゴヌクレオチドプローブを合成し、FISH解析を行い、KSU-1が球状の凝集体を形成し、その周囲をZoogloea細菌が包んでいる特異な存在状態であることが明らかとなった。
つぎに、Anammox反応で中心的な役割を演じているヘムタンパク質のhaoのバイオフィルムからの抽出およびカラムクロマトグラフィーによる精製を行った。陰イオン交換カラム、およびゲルろ過クロマトグラフィー、分子量5万を透過する透析膜によってほぼ均一までhaoを精製できた。精製したhaoは、硝化菌Nitrosomonas europaeaのhaoと比較し、分子量約11万(ゲルろ過、SDS-PAGEとも)と小さく、hetro-dimerを形成することなどかなり異なることが判明した。紫外、可視吸光スペクトルは還元型で460nmにhaoに特徴的な吸光極大を認めた。ヒドロキシルアミンよりもヒドラジンによるスペクトル変化が大きく、ヒドラジンに対する親和性が高いように思われた。

研究成果

• [文献書誌] U.Imajo, H.Ishida, T.Fujii, H.Sugino, J.Rouse, K.Furukawa: "Detection of anammox activity from activated sludges"Asian water qual 2001, Asia-pacific regional conference proceeding. (CD-ROM). (2001)
• [文献書誌] K.Furukawa, J.Rouse, U.Imajo, H.Sugino, T.Fujii: "Establishment of an aerobic ammonium-oxidizing culture in continuous treatment with non-woven biomass carrier"Proceeding of Water environment federation, 74th annual conference and exposition. (CD-ROM). (2001)
• [文献書誌] T.Fujii, H.Sugino, J.D.Rouse, K.Furukawa: "Characterization of the microbial community in an anaerobic ammonium-oxidizing biofilm cultured on a nonwoven biomass carrier"Journal of Bioscience and Bioengineering. 94. 412-418 (2002)