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1.実生のサンプリング
平成13年度の研究結果より、本研究の目的に合致した適切なサンプリング時期を播種後4、6、8、10、12、14日目とした。プラントボックス(Magenta G7)に50粒づつ無菌播種し、それぞれの時期に生体重で約20gの実生地上部を確保した。サンプリングした実生地上部は、すぐに液体窒素で凍結後、-80℃で貯蔵した。
2.FT、LEY相同遺伝子の検索
シロイヌナズナで花成を制御する遺伝子として明らかになっているFT、LEYについて、上記のサンプリング時期における発現の有無を検討した。プライマーを設計し、RT-PCRにより得られたcDNAのクローニングを行い、塩基配列の解析を行った。しかし、得られたクローンのFTおよびLEYとの塩基配列の相同性は50%以下と低く、ケイトウの発育相転換時(播種後6〜12日:平成13年度研究成果より)にはFT、LEYの発現はないものと結論した。
3.ディファレンシャルディスプレイ法による特異的発現遺伝子の探索
窒素無添加培地においてケイトウが生殖生長へと転換する時期に特異的に発現する遺伝子を探索するため、窒素無添加培地および窒素添加培地で育成した実生のmRNAをFluorescent Differential Display法を用いて比較した。RT-PCRは9種の蛍光Downstream primerと24種のUpstream primerを組み合わせた216通りのうち、25通りを実施した。その結果、播種後4〜12日目に窒素無添加培地で強く発現するmRNAバンドが8本確認された。これらをクローニングしpoly-A配列が確認された27種頚のクローンについて塩基配列の解析を行ったところ、14クローンはチューブリン関連遺伝子など既知であったが、13クローンは未知の遺伝子であった。これらの一部についてノーザンハイブリダイゼーションを行い発現時期の解析を行ったが、窒素無添加培地でのみ特異的に発現する遺伝子を特定できなかった。現在のところ、花成に関わると特定できる遺伝子は見つかっていない。
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