環境遺伝子資源からの新規環境汚染物質分解酵素遺伝子の取得と解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13660078
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 永田 裕二 東北大学, 大学院・生命科学研究所, 助教授 (30237531)
• 研究分担者: 津田 雅孝 東北大学, 大学院・生命科学研究所, 教授 (90172022)
• キーワード: 環境汚染物質川 / 環境遺伝子資源 / 芳香族化合物酸化酵素 / ハロアルカンデハロゲナーゼ / 脱塩化水素酵素 / 難培養性細菌 / 機能相補 / 土壌ライブラリー

研究概要

これまでに多くの環境汚染物質分解資化菌が単離され、その代謝に直接関与する酵素遺伝子群の解析が行われてきている。しかし、従来の方法では、まず、ある物質に対する分解資化菌の単離、培養というプロセスを経るために、それがバイアスとなり、獲得される分解菌、酵素遺伝子はどれも類似なものばかりであった。そこで、本申請研究では、集積培養やプレート上でのコロニーの形成などの培養プロセスを経ずに直接土壌環境中から単離したDNAを遺伝子資源として用いて新規の環境汚染物質分解酵素遺伝子を取得し、それを解析、応用することを目的とした。本年度は、まず、土壌から直接DNAを抽出し、制限酵素での切断が可能なまでに精製する方法を確立した。また、抽出DNAよりユニバーサルプライマーを用いて16S rRNA遺伝子を増幅し、本DNAに培養不能細菌として報告されている細菌由来のDNAが含まれることを確認した。一方、(1)芳香族化合物初発酸化活性、(2)加水分解的脱ハロゲン活性、(3)BHC脱塩化水素活性を有する遺伝子が導入されると、それぞれ、ナフタレン、ハロアルカン、BHCで生育が可能となる宿主を構築、あるいは取得した。この宿主の有効性は、既得遺伝子(nahA,linB,linA)を広宿主域ベクターで導入することにより確認した。更に、広宿主域コスミドベクターを用いて、土壌から直接抽出、精製したDNAより「土壌ライブラリー」を構築し、これらの宿主への導入を開始した。現在までに新規遺伝子の取得には至っていないが、その基盤の構築は達成できたと考えている。

研究成果

• [文献書誌] S.Marvanova, Y.Nagata, M.Wimmerova, J.Sykorova, K.Hynkova, J.Damborsky: "Biochemical characterzation of broad-specificity enzymes using multivariate experimental design and a colorimetric microplate assay : characterization of the haloalkane dehalogenase mutants"J.Microbiological Methods. 44. 149-157 (2001)
• [文献書誌] L.Trantirek, K.Hynkova, Y.Nagata, A.G.Murzin, A.Ansorgova, V.Sklenar, J.Damborsky: "Reaction mechanism and stereochemistry of gamma-hexachlorocyclohexane dehydrochlorinase LinA"J. Biol. Chem.. 276・11. 7734-7740 (2001)
• [文献書誌] Y.Ohtsubo, M.Delawary, K.Kimbara, M.Takagi, A. Ohta, Y.Nagata: "BphS, a key transcriptional regulator of bph genes involved in PCB/biphenyl degradation in Pseudomonas sp.KKS102"J. Biol. Chem.. 276・39. 36146-36154 (2001)
• [文献書誌] J.Damborsky, J., E.Rorije, A.Jesenska, Y.Nagata, G.Klopman, W.J.G.M.Peijnenburg: "Structure-specificity relationships for haloalkane dehalogenases"Environ. Toxi. Chem.. 20・12. 2681-2689 (2001)
• [文献書誌] Y.Nagata, K.Mori, M.Takagi, A.G.Murzin, J.Damborsky: "Identification of Protein Fold and Catalytic Residues of gamma-hexachlorocyclohexane Dehydrochlorinase LinA"Proteins : Structure, Function, and Genetics. 45. 471-477 (2001)
• [文献書誌] K.Miyauchi, H.-S.Lee, M.fukuda, M.Takagi, Y.Nagata: "Cloning and characterization of linR, involved in regulation of downstream pathway for gamma-HCH degradation in Sphingomonas paucimobilis UT26"Appl. Environ. Microbiol.. 68・4(in press). (2002)