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(1)熱ショックのin vitroシュミレーションによるHrcA-DNA複合体の熱安定性の調査
His-tagをN末端に付加した形で大腸菌で発現させ、金属アフィニテイクロマトグラフィで精製したHrcAを用いて、溶液系での様々な温度でのHrcAタンパク質の変性を光散乱光度分析により調べた。その結果、CIRCEを含むプラスミドpTY-1が共存すると、HrcAタンパク質は複合体を形成して可溶化されることが判った。この複合体は、元株であるBacillus thermoglucosidasius KP1006の至適生育温度付近以下(60℃)では安定に存在したが、その温度を超えると急激に安定性を失うことが判った。また中温菌Bacillus subtilis由来のHrcAを同様に調べると、生育温度を越える50℃で凝集が生じることが判った。このことは、HrcAが生育温度を境に、複合体が破壊され熱ショック応答のスイッチが入るというモデルを裏付ける結果である。
(2)HrcAタンパク質のDNA結合領域の特定
HrcAタンパク質の一次構造から高次構造予測を行い、DNA結合モチーフであるHelix-Turn-Helixを特定した。これらの配列は、他の起源のHrcAについても良く保存されていた。そしてこの中に含まれかつ保存性の高い塩基性アミノ酸Lys31とArg43に注目し、それぞれPro及びAspに置換した変異タンパク質(K31P及びR43D)を作成し、精製した。これら2つの変異タンパク質と野生型タンパク質のCIRCE結合能をゲルシフト分析法で比較した。K31P及びR43Dは、それぞれ1/3、1/16にHrcAタンパク質との結合能を低下させていることが判り、これら2つの残基がある領域が、CIRCEとの結合に重要であることが明らかになった。
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