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木材分解力の大きなラッカーゼ活性の高い軟腐朽菌Graphium sp.M-1-9から、ラッカーぜを分離・精製し、その構造を明らかにし、種々の物理化学的性質を検討するために以下の実験を行った。前年度までの実験の結果から精製法を以下のように変更した。
1.供試菌をブナ木片添加培地で培養後、菌体外分泌物質を抽出し、硫安沈殿物を得た。
2.1.で得られたサンプルをオープンカラムによってPhenyl Sepharoseで疎水クロマトグラフィー、DEAE Sepharose CL-6Bを用いてイオン交換クロマトグラフィー、FPLCによってHiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HPカラムで疎水クロマトグラフィー、さらにSMART Systemでゲルろ過クロマトグラフィーを行った。
3.SDS-PAGEを行った後、PVDF膜に転写し、染色後タンパク質のバンドを切り出した。それを用いてプロテインシーケンサーによりN末端アミノ酸配列を解析する予定であったが、バンドは検出できるが、解析不能であった。そこでSMART Systemでゲルろ過後Prosorbに吸着後乾燥させ、よく洗浄して塩をのぞいて乾燥させたものを解析中である。
4.配列決定後、相同性検索によってラッカーゼを特定する。
5.他の数種の白色腐朽菌は木材を分解する際に、フェノールオキシダーゼとともに低分子の水酸化ラジカル生成糖ペプチドを分泌することが既に我々によって報告されている。供試菌においても同様な物質が関与しているのか検討するために、供試菌を同様に培養し、菌体外分泌物質を抽出し硫安沈殿物をSephadex G-50によってゲルろ過後、低分子画分を回収した。
6.低分子画分の一電子酸化活性、タンパク質および中性糖、2価鉄含量の測定を行った。また水酸化ラジカル生成機構を検討した。
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