三重鎖DNA結合蛋白質の高次構造と三重鎖DNA認識機構

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13670133
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 鳥越 秀峰 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 先任研究員 (80227678)
• 研究分担者: 緒方 一博 横浜市立大学, 医学部・生化学第一講座, 教授 (90260330)
• キーワード: 三重鎖DNA / 三重鎖DNA結合蛋白質 / STM1蛋白質 / 大量発現 / 結合定数

研究概要

三重鎖DNAはホモプリン・ホモピリミジン二重鎖(pur・pyr)の主溝に沿ってホモピリミジン単鎖あるいはホモプリン単鎖がHoogsteen型の水素結合をすることにより形成される。pur・pyr配列は真核生物のゲノム中に広く分布し、遺伝子発現の調節領域や組み換えのホットスポットに位置することから、三重鎖DNAが遺伝子発現調節や組み換えに関与すると考えられている。本研究課題では三重鎖DNAに特異的に結合する蛋白質として最近単離されたSTM1蛋白質を解析した。
本年度の研究では、まず出芽酵母の染色体DNAよりPCRでstml遺伝子全長の断片を増幅し、pETベクターに挿入し、大腸菌内でT7プロモーターを用いてSTM1蛋白質を大量発現する系を構築した。この大量発現した蛋白質をほぼ単品にまで精製することに成功した。またSTM1蛋白質が種々のDNA構造、(1)ホモプリン・ホモピリミジン二重鎖DNAにホモプリン単鎖が結合した三重鎖DNA(Pur triplex)、(2)ホモプリン・ホモピリミジン二重鎖DNAにホモピリミジン単鎖が結合した三重鎖DNA(Pyr triplex)、(3)G-rich単鎖とC-rich単鎖とからなる二重鎖DNA(Pur duplex)、(4)A-rich単鎖とT-rich単鎖とからなる二重鎖DNA(Pyr duplex)および(5)G-rich単鎖に結合する強さを解析した。STM1蛋白質はこの中ではPur triplexに最も強く結合した。同じ三重鎖のPyr triplexにも結合したが、Pur triplexへの結合よりも数十倍弱かった。またPur duplexにも結合したが、Pur triplexへの結合よりも数十倍弱かった。同じ二重鎖のPyr duplexにはほとんど結合しなかった。またG-rich単鎖への結合も非常に弱く、Pur triplexへの結合よりも数千倍弱かった。これらの結合解析以外に、さらに大腸菌から精製したSTM1蛋白質の三次元構造解析を展開しつつある。

研究成果

• [文献書誌] Torigoe, H., Obika, S., Imanishi, T.: "Promotion of Triplex Formation by 2 -O, 4 -C-Methylene Bridged Nucleic Acid (2, 4 -BNA)Modification : Thermodynamic and Kinetic Studies"Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20. 1235-1238 (2001)
• [文献書誌] Torigoe, H: "Promotion of Triplex Formation by N3'-P5' Phosphoramidate Modification : Thermodynamic and Kinetic Studies"Nucleic Acids Res.. 29・sl. 57-58 (2001)
• [文献書誌] Torigoe, H., Akaike, T., Maruyama, A.: "Synergistic Stabilization or Triplex by Combination of Comb-type Cationic Copolymer and Oligo-N3'-P5' Phosphoramidates"Nucleic Acids Res.. 29・sl. 195-196 (2001)
• [文献書誌] Torigoe, H., Hari, Y., Obika, S., Imanishi, T.: "Triplex Formation Involving 2'-4'-BNA with 2-Pyridone Base Analogue : Efficient and Selective Recognition of C : G Interruption"Nucleic Acids Res.. 29・sl. 281-282 (2001)
• [文献書誌] Torigoe, H., Maruyama, A.: ""Promotion of Duplex and Triplex DNA Formation by Polycation Comb-Type Copolymers" in "Nonviral Vectors for Gene Therapy" edited by Mark A. Findeis, a volume of Methods in Molecular Medicine"Humana Press Inc., Totowa, NJ. 209-224 (2001)