|
これまでに、microdissectionの比較的容易な食道扁平上皮癌を用いて、病変ごとに多数箇所サンプリングし、HUMARAによる単クローン性の証明、DOP-PCR CGHによる初期の染色体変化の抽出を行い、国際誌に発表した。しかし、DOP-PCRで増幅・標識したDNAと増幅せずnick translation(NT)で標識したDNAとの間で、CGHの結果に微妙に差がみられた。
この差の原因を解明するために、まず、これまでにpainting FISHとCGHで絶対的なコピー数の明らかにした培養系を用いて、腫瘍細胞に見られるDNAのコピー数の増減が、DOP-PCRで増幅する過程、あるいは標識の過程で変化してしまわないかどうかを検討した。
その結果、標識方法の影響が大きく、DOP-PCR後にNT標識をすればPCR増幅せずにNT標識をした場合とCGHの結果はほとんど変わらないがPCR標識ではartifactが増えることがわかった。また、リアルタイムPCRでPCR増幅のphase間(exponentialかplateauか)でCGHの結果を比較したところ、有意な差は見られなかった。そのために以後の検討はplateau phaseまでDOP-PCRを行いNTで標識することにした。その条件下で、培養細胞と正常細胞、またはDNA-diploidの培養細胞とDNA-tetraploidの培養細胞を種々の割合で混合してDOP-PCRで増幅したものとしなかったものとの間でCGHの結果を比較した。現在データの解析を行っている。この方法論の検討と平行して、細胞単離の困難さからこれまでほとんどデータのない、未分化型の胃癌の組織切片から、laser capture microdissectionで得られた微小組織をDOP-PCRで増幅、NTで標識してCGHを行い、最近ようやくデータが出始めた。これで、原発腫瘍に応用できる準備が整ったと考えている。この応用が平成14年度の目標である。
|
