腸管出血性大腸菌O157Sakaiの初期感染に関与する新規付着因子の解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13670263
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 立野 一郎 東京大学, 医科学研究所, 助手 (50311642)
• キーワード: O157 / Adherence / 付着 / LEE

研究概要

腸上皮細胞への付着は、腸管出血性大腸菌(EHEC)による感染の初期段階において必須である。その付着に関する領域としてLEEにコードされたTypeIII分泌機構と外膜蛋白質intiminの存在が知られている。ところが、ゲノムシークエンスの結果は、LEE以外にも付着を司る可能性のあるいくつかの領域が存在することを明らかにした。そこで、本研究では新規付着因子が存在する可能性を調査する目的で、人大腸上皮由来Caco-2細胞への付着能の上昇を示すトランスポゾン挿入変異株としてyhiE遺伝子に挿入を持つ株とyhiF遺伝子に挿入を持つ株の2種類の変異株を解析した。その結果、これら両遺伝子は転写制御因子と相同性のあるアミノ酸配列をコードしており、さらに、それらの変異株のTypeIIIおよび新規付着因子をコードする可能性のある領域がRNAレベルで活性化されていた。そこでさらに、1)これら2種類の変異株が示す高付着能がyhiE遺伝子およびyhiF遺伝子の破壊によるものであるかを調べた。2)高付着能を示した原因がLEE以外の未知の付着因子による可能性について検討した。3)さらに、マウスモデルを用いて高付着変異株の定着性を試験した。
(方法)1)O157SakaiからyhiEまたはyhiF遺伝子のin-frame欠損変異株O157TΔyhiEまたはO157TΔyhiFを作成した。付着能は、人大腸上皮癌由来のCaco-2細胞に4時間感染させた後、細胞に付着した菌数から評価された。2)yhiE挿入変異株、yhiF挿入変異株、及び親株(野生株)のTypeIII変異株を作成し、それぞれG1-C5ΔespADB、C8-C8ΔespADB、O157TΔespADBとした。3)マウス:SPF,雌性ICRマウス(4週令)。供試菌:臨床分離株O157Sakai、O157SakaiのyhiE遺伝子挿入変異株(G1-C5)およびeae遺伝子欠損株(Δeae)。接種法:シメチジン処置後1.0×10^<11>cfu/kgの菌縣濁液を経胃摂取した。
(結果)1)O157TΔyhiEまたはO157TΔyhiFともに親株であるO157Sakaiにくらべて著しく高い付着能を示した。2)今回作成したすべてのTypeIII変異株の付着能がCaco-2細胞に対する付着能を失った。3)G1-C5は7匹中6匹で摂取2週後までに糞便中に10^2cfu/g feces以上検出されたが、野生株は約半数のマウス(6/14匹)で検出限界(10^2cfu/g feces)以下となった。
(考察)yhiEとyhiFがTypeIII分泌機構および分泌タンパク質の発現を介してO157の初期付着に関与する可能性が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Abe H, Tatsuro I et al.: "Bicarbonate ion stimulates the expression of locus of enterocyte effacement-encoded genes in enterohemorragic Escherichia coli O157:H7"Infection and Immunity. 70・7. 3500-3509 (2002)
• [文献書誌] Tatsuro I et al.: "toxB Gene on pO157 of enterohemorragic escherichia coli O157:H7 is required for full epithelial cell adherence phenotype"Infection and Immunity. 68・11. 6660-6669 (2001)
• [文献書誌] Ogawa, M., Suzuki, T., Tatsuro, I.et al.: "ICSB, secreted Via the typeIII secretion system, is chaperoned by IpgA and required at the post-invasion stage of shigella pathogenicity"Molecular Microbiology. (in press). (2003)
• [文献書誌] Tatsuno, I. et al.: "Hyper Adherence to Caco-2 Cells caused by disruption of yhiE and yhiF genes in Enterohemorrhagic Escherichia coli O157 : H7"Infection and Immunity. 71・5(in press). (2003)