細菌由来免疫調節性CpG-DNAによる発現が誘導される遺伝子の解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13670269
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 内嶋 雅人 浜松医科大学, 医学部, 助手 (20252174)
• 研究分担者: 青枝 大貴 浜松医科大学, 医学部, 助手 (10324344) ; 永田 年 浜松医科大学, 医学部, 助教授 (90275024) ; 小出 幸夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (30126809)
• キーワード: CpG-DNA / 遺伝子発現 / サブトラクション / 転写調節 / 免疫調節

研究概要

細菌由来免疫調節性CpG-DNAにより特異的に発現が誘導される遺伝子を同定するとともに、その発現誘導機構を解析する。これらの結果からCpG-DNAによる免疫調節機構を明らかにしていくことが本研究の目的である。
CpG-DNAまたはnon-CpG-DNAで刺激したBALB/cマウスの脾細胞より調製したmRNAを用いて、Suppression Subtraction Hybridization(SSH)法により作製したサブトラクションライブラリーの解析をすすめた。ほとんどのクローンがマウス遺伝子のデータベースに一致したが、そのうちの約4割が遺伝子産物(タンパク質)の機能が不明なものであった。
RT-PCR法により、転写因子であるNFκB-p105(p50前駆体)、IRF-1、免疫プロテアソームの構成成分であるPA28β、Toll様レセプターのアダプター分子であるMyD88、インターフェロン誘導遺伝子であるIRG2などがCbG-DNAにより発現誘導されることを確認した。さらに脾臓細胞、マウスマクロファージ用細胞株、骨髄由来マクロファージ(BMDM)、樹状細胞を用いて、CpG-DNA刺激によるこれらの遺伝子の発現を比較した結果、BMDMが最も応答性が高かった。また、経時的な遺伝子発現を解析した結果、p105などの転写因子はCpG-DNA刺激後1時間で発現誘導されたが、IRG2などは3時間後位から発現が誘導された。遺伝子産物の機能が不明なものについては、発現の確認とともにその機能解析が今後の課題である。CpG-DNA刺激により遺伝子発現誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の転写調節領域の解析を行なった。転写開始点より500塩基上流のAP-1様配列が、強いCpG-DNA応答性を示すことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Uchijima, M. et al.: "Identification of immunostimulatory DNA-induced genes by suppression subtractive hybridization"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 286(4). 688-691 (2001)
• [文献書誌] Yokota, N. et al.: "Identification of differentially expressed genes in rat hippocampus after transient global cerebral ischemia using subtractive cDNA cloning based on polymerase chain reaction"Stoke. 32(1). 168-174 (2001)
• [文献書誌] Yoshida, A. et al.: "Protective CTL response is induced in the absence of CD4+ T cells and IFN-gamma by gene gun DNA vaccination with a minigene encoding a CTL epitope of Listeria monocytogenes"Vaccine. 12(30). 4297-4306 (2001)
• [文献書誌] Nagata, T. et al.: "Immunization with plasmid DNA encoding MHC class II binding peptide/CLIP-replaced invariant chain (Ii) induces specific helper T cells in vivo : the assessment of Ii p31 and p41 isoforms as vehicles for immunization"Vaccine. 20(1-2). 105-114 (2001)
• [文献書誌] Nagata, T. et al.: "Induction of protective immunity to Listeria monocytogenes by immunization with plasmid DNA expressing a helper T-cell epitope that replaces the class II-associated invariant chain peptide of the invariant chain"Infect. Immun.. 70(5). 2676-2680 (2002)
• [文献書誌] Nakamura, Y. et al.: "Induction of Protective Immunity to Listeria monocytogenes with Dendritic Cells Retrovirally Transduced with a Cytotoxic T Lymphocyte Epitope Minigene"Infect. Immun.. 71(4). 1748-1754 (2002)