| 研究概要 |
1.有核細胞発現プラスミドの作成tetracycline(Tet)で発現誘導のできる強力なブロモーターの下流にProteinase inhibitor-9(PI-9)cDNAを構築した。エストロゲン受容体を恒常的に発現するHepG2細胞HepG2-ER7(J Biol Chem275, 5867-5873, 2000)を24時間エストロゲンにて刺激することにより、PI-9mRNAの発現誘導を行なった。細胞よりRNAを回収し、RT-PCR法にてPI-9cDNAを得た。PCR産物をSacII-NotIで消化し、pUHD10-3(Science248, 480-483, 1990)のSacII-XbaI siteに構築した。このプラスミドをpTRE-PI-9とした。導入したDNA断片の配列は両向きから塩基配列を読むことにより確認した。また、pTRE-PI-9が機能するPI-9を発現することを、HepG2細胞を用い、一過性遺伝子導入を行ない、細胞より蛋白を回収し、ウェスタンブロット法を行なうことにより確認した。
2.PI-9ステーブル発現細胞の樹立 ヒト肝細胞株HepG2にtransactivatorであるVP16/tetO発現プラスミドをG418をselection markerとし導入した細胞株HY-ToffにpTRE-PI-9をHindIIIで消化後、遺伝子導入し、Puromycineで選択することにより、ステーブル発現細胞を樹立した。これらのステーブル発現細胞のRNA、蛋白をそれぞれRT-PCR法、ウェスタンブロット法で解析し、RNAレベル、蛋白レベルで高レベルのPI-9の発現を認め、Tetにより、その発現が抑制されることを確認した。
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