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1.大腸菌発現プラスミドの作成および大腸菌でのProteinase inhibitor-9(PI-9)発現、精製 PromegaのPinPoint XaProtein Purification Systemを用いてPI-9の発現、精製を試みた。大腸菌発現プラスミドであるPinPoint Expression vectorにPI-9cDNAを構築した。大腸菌に同プラスミドを導入し、Biotin化したPI-9融合淡白を発現させた。Avidin resinを用いて蛋白を精製し、Biotin標識されたtag蛋白を切断した。蛋白の同定は電気泳動後の銀染色、また、ウエスタンプロット法を行なうことにより試みた。
2.PI-9ステーブル発現細胞の樹立 昨年度樹立したPI-9ステーブル細胞株をさらに樹立し、より効率の良いPI-9の発現の見られる細胞株を得た。ヒト肝細胞株HepG2にtransactivatorであるVP16/tetO発現プラスミドをG418をselection markerとし導入した細胞株HY-ToffにpTRE-PI-9をHindIIIで消化後、遺伝子導入し、puromycineで選択することにより、ステーブル発現細胞を得た。これらのステーブル発現細胞のRNA、蛋白をそれぞれRT-PCR法、ウェスタンブロット法で解析し、RNAレベル、蛋白レベルで高レベルのPI-9の発現を認めた。今年度はPI-9発現量が多く、tetracyclineにより発現調整をより効率良く受けるクローンを同定した。
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