| 研究課題/領域番号 |
13670462
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
宮崎 義継 長崎大学, 医学部附属病院, 講師 (00311861)
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| 研究分担者 |
河野 茂 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (80136647)
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| キーワード | Cryptococcus neoformans / アゾール系抗真菌薬 / ERG11 / 薬剤感受性 / アゾール耐性 / 深在性真菌症 |
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| 研究概要 |
(1)ターゲット分子の配列確認:アゾール耐性Cryptococcus neoformans株NUCR1148株および感受性株NUCR1147の14-apla-demethylase(アゾールの標的分子)をコードするERG11遺伝子を増幅し、そのPCR断片のシークエンスを確認し、野生型(感受性株)と耐性型のアミノ酸配列の比較を行なった。その結果、484番目のグリシンがセリンに替わる遺伝子変異を見出した。
(2)クローニング:上記の変異を有するERG11のORF(open reading frame)を含むcDNAのサブクローニングを行った。NUCR1148株(耐性)およびNUCR1147株(感受性)から、それぞれERG11遺伝子のcDNAを作成し、それぞれをGALプロモーターを有するベクターに組み込み、それぞれpCN48EG11およびpCN47EG11とした。
(3)形質転換による表現型(感受性)の確認:pCN48EG11およびpCN47EG11を用いて、Saccharomyces cerevisiae DKS1株のtransformationをおこなった。ガラクトースとグルコース添加によりtranscriptionレベルでオン・オフを調節できるため、組み込んだERG11の配列の違いによる薬剤感受性を調べた。プロモーターオフ(グルコース添加)の状態では、変異の有無による薬剤感受性の変化はみられなかったが、ガラクトース添加によりプロモーターOnにすると、S484Gの変異を有する形質転換株ではフルコナゾールMICの有意な上昇(2μg/ml→8μg/ml)が認められた。また、ERG11のS484GはアムホテリシンB感受性に関しては、影響を与えなかった。
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