プロテアソーム-PCNA複合体の構成蛋白とその免疫応答の解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13670476
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 高崎 芳成 順天堂大学, 医学部, 助教授 (80154772)
• 研究分担者: 竹内 健 順天堂大学, 医学部, 講師 (20281355)
• キーワード: proteasome / PCNA / DNA replication / autoantibody / autoantigen / autoimmunity

研究概要

抗PCNAマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、TOB7,TO17およびTO30をBALB/cヌードマウス腹腔内に注入し、その後得られた腹水より硫安塩析およびHPLCゲル濾過法で各モノクローナル抗体を精製した。これら抗PCNAモノクローナル抗体をCNBr活性化セファロース4Bに吸着し、アフィニティーカラムを作成し、ウサギ胸腺アセトンパウダーPBS抽出液を抗原源としてPCNAが他の蛋白と結合したPCNA複合体を精製した。この精製PCNA複合体の特性を抗PCNAモノクローナル抗体に加え、RPA、DNA helicase II,p21,CDK4,CDK5、などに対するモノクローナル抗体、さらに20Sプロテアソームαおよびβ subunit,PA700 ATPase subunit,p52 subunitなどのモノクローナル抗体を用い、免疫ブロット法(IB)で解析した。その結果、このPCNA複合体にはいくつかの異なる蛋白結合体が含まれることが明らかとなった。その一つはDNAの複製に関与するいわゆる"DNAフォーク"で、二つ目は細胞周期の制御に関与するPCNA-p21-cyclin-CDK結合体であることを証明し、報告した(J Immunol 166. 2001)。さらに20Sプロテアソームαおよびβ subunit, PA700 ATPase subunit, p52 subunitなどのモノクローナル抗体および抗Ki(PA28γ)抗体陽性SLE患者を用い免疫沈降(IP)にて解析を進めた結果、PA700、PA28γおよび20SプロテアソームがPCNAと結合していることを見いだした。この結果はいわゆるhybride typeのプロテアソームがPCNAの蛋白制御に関与していることを示唆する新たな所見で、従来から指摘されていたPCNAとKi(PA28γ)の免疫応答の関与を解明する所見として注目された。現在我々は全身性性エリテマトーデス患者におけるこれら一連の蛋白結合体に対する免疫応答の関連性について検討を加えている。

研究成果

• [文献書誌] Takasaki Y., Kogure T., Takeuchi K., Yano T., Hirokawa K., Hirose S., Shirai T., Hashimoto H.: "Reactivity of anti-proliferating cell nuclear antigen (PCNA) murine monoclonal antibodies to the PCNA multiprotein complexes involved in cell proliferation"J. Immunol.. 166. 4780-4787 (2001)
• [文献書誌] Haruta K., Kobayashi S., Tajima M., Sakai A., Tamura N., Bando H., Hara M., Kawashima S., Takasaki Y., Hashimoto H.: "Effect of immune complexes in serum from patients with rheumatoid vasculitis on the expression of cell adhesion molecules on polymorphonuclear cells"Clin. Exp. Rheumatol.. 19. 59-68 (2001)
• [文献書誌] Fujinaga H., Takeuchi K., Kaneda K., Takasaki Y., Hashimoto H.: "Analysis of autoantibodies to cell cycle associated antigens"Modern Rheumatol.. 11. 221-229 (2001)
• [文献書誌] Kawaguchi R., Takasaki Y., Hirokawa K., Takeuchi K., Kaneda K., Hashimoto H.: "Characterization of autoantibodies to 60-KUSS-A, 52-KUSSA and SS-B in Japanese lupus mother with neonatal lupus syndrome"Jpn. J. Clin. Immunol. 24. 291-302 (2001)
• [文献書誌] Suzuki J., Morimoto S., Amano H., Tokano Y., Takasaki Y., Hashimoto H.: "The serum level of interleukin-15 in patients with rheumatic isenses"J. Rheumatol.. 28. 2389-2391 (2001)