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1.(ELISpotアッセイ系開発のための)TGF-β latent formに対する活性化能を有するペプチドに関する検討
TGF-β latent formに対する活性化能を有すると報告されている複数のpeptideを合成し、それぞれの活性化能をHClの活性化能と比較した。各peptideの括性化能はHClの活性化能の7%以下であり、ELISpotアッセイ系に用いるには十分でないことが明らかとなった.
2.末梢血単核球(PBMC)によるTGF-β産生に関する検討
(1)HCV非特異的(constitutive)TGF-β産生:HCV感染患者および健常者の末梢血単核球(PBMC)から、Monocyte分画・helper T細胞分画を調製し、モれぞれを37℃・16時間培養した後の培養上清中のTGF-β量をEIA法により測定した。その結果、constitutiveなTGF-β産生・分泌を担う主たる分画はMonocyteであることが明らかになった。
(2)HCV蛋白によるTGF-β産生・分泌の抑制:PBMCをHCV core蛋白あるいはNS3蛋白の存在下で37℃・4時間、さらに、HCV蛋白非存在下で16時間培養した。培養上清中のTGF-β量の測定により、HCV core蛋白・NS3蛋白がPBMCおけるTGF-β産生・分泌を抑制することが明らかになった。PBMCから調製したMonocyte分画をHCV蛋白存在下で4時間、続いてHCV蛋白非存在下で16時間培養した場合にも、PBMCをHCV蛋白存在下で4時間培養後にMonocyte分画を調製し、さらにHCV蛋白非存在下で16時間した場合と同様のTGF-β産生・分泌の抑制が認められた。したがって、この抑制には、免疫機構に関与する細胞間のネットワークを介さず、HCV core蛋白・NS3蛋白が直接PBMC・Monocyteに作用しTGF-β産生・分泌を抑制する機序が関与していることが示唆された。この機序の解明に用いるために、HCV 1b型のcore蛋白・NS3蛋白を発現するプラスミドをデザインし、作製した。このプラスミドをHuH7細胞に導入することにより、HCV蛋白が産生されることをウエスタン・ブロット法により確認した。
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