| 研究課題/領域番号 |
13670703
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
加藤 秀樹 浜松医科大学, 医学部, 助手 (80314029)
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| 研究分担者 |
林 秀晴 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50135258)
寺田 肇 浜松医科大学, 医学部・附属病院, 講師 (50252177)
佐藤 洋 浜松医科大学, 医学部・附属病院, 助手 (30293632)
本荘 晴朗 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教授 (70262912)
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| キーワード | ミトコンドリア / 共焦点レーザー顕微鏡 / calcein / permeability transition pore / saponin / cyclosporin A |
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| 研究概要 |
心筋細胞において、ミトコンドリア(Mito)のATP感受性K^+チャネル開口薬であるDiazoxideがMitoのpermeability transition pore(mPTP)を介してCa^<2+>を放出し、Ca^<2+> sparkとCa^<2+> transientを増大させることを報告してきた。平成13年度は、このmPTPの開口を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像法により直接評価する方法を検討した。ラット単離心室筋細胞にcalcein/AM(20μM)を室温で20分間負荷した。同時にコバルト(5mM)をloading溶液に添加することで、細胞質に分布した色素は除去した。(1)電位依存性にMitoに選択的に集積するTMREと同時に染色すると、calceinのimageとTMREのimageは分布が完全に一致した。また、この同時染色を長時間行うと、色素間の相互作用によりcalceinの蛍光強度が減弱した。(2)calceinを負荷した後に、saponin(0.05mg/ml)を用いて細胞膜をpermeabilizeし、細胞質の色素を除去しても、蛍光強度の減少は10%以下であった。(3)Diazoxide(200μM)を10分間投与すると、calceineの蛍光強度は16%減少し、この効果はmPTPの選択的な阻害剤であるcyclosporin Aにより完全に抑制された。以上より、calceinとコバルトを同時に用いることにより、calceinがMitoへ選択的に負荷され、このcalcein蛍光の減少がmPTP開口の指標となりうることが示された。また。DiazoxideがmPTPを開口することが画像法を用いて確認された。
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