| 研究課題/領域番号 |
13670703
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
加藤 秀樹 浜松医科大学, 医学部, 助手 (80314029)
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| 研究分担者 |
林 秀晴 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50135258)
寺田 肇 浜松医科大学, 医学部付属病院, 講師 (50252177)
佐藤 洋 浜松医科大学, 医学部付属病院, 助手 (30293632)
本荘 晴朗 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教授 (70262912)
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| キーワード | ミトコンドリア / 共焦点レーザー顕微鏡 / calcium / permeability transition pore / saponin / cyclosporin A / diazoxide |
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| 研究概要 |
心筋細胞において、ミトコンドリア(Mito)のATP感受性K^+チャネル開口薬であるDiazoxide(Dz)が、Mitoのpermeability transition pore(mPTP)を介してCa^<2+>を放出し、Ca^<2+>sparkとCa^<2+>transientを増大させることを報告してきた。また、mPTPの開口を共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像法により直接評価する方法を開発し、Dzによりcalceineの蛍光強度が低下し、この効果はmPTPの選択的な阻害剤であるcyclosporin Aにより完全に抑制されることから、DzがmPTPを開口することも示してきた。今回はミトコンドリア内のCa^<2+>濃度([Ca^<2+>]m)の測定法を新たに考案し、Dzの[Ca^<2+>]mに対する作用を検討した。心室筋細胞を蛍光色素のrhod-2/AMを負荷した後に、saponin(0.05mg/ml)で細胞膜をpermeabilizeして、514nmで励起時の>560nmでの蛍光強度から[Ca^<2+>]mを測定した。灌流液のCa^<2+>濃度を177μM、300μM、600μM、と変化させると、[Ca^<2+>]mは変化した。Ruthenium Redを用いて、Mitoへの主なCa^<2+>流入経路であるuniorterを抑制すると、この変化は完全に消失した。これらの結果は、rhod-2とsaponinを用いることで、permeabilized myocyteにおいて、[Ca^<2+>]mを測定可能であることを示している。次に、この方法を用いてDzの効果について検討した。Dz(1μM、5μm、10μm)は濃度依存性に[Ca^<2+>]mを減少したが、これは以前に我々が報告した、mPTPを介したMitoからのCa^<2+>の放出によるためと考えられた。
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