| 研究概要 |
Matrix metalloproteinase (MMP)-9と、one-hybrid法により見いだされた本遺伝子promoter KRE-M9結合蛋白、differentiation repressing factor (DRF)-1候補(以下D候補と略)とのアポトーシスにおける関与について検討した。結果、1、D候補はスプライシングによりα、βとして存在、遺伝子導入培養293T細胞でKRE-M9結合性の約80kDa核蛋白と細胞質蛋白量が増加した。2、培養ケラチノサイト(以下KCと略)に遺伝子導入、特にD候補βでザイモグラフ法でMMP-9発現を抑制した。3、分化誘導高Ca^<2+>刺激KCで、(1)D候補が核から細胞質に移動、選択的MMP-9発現誘導を認め、(2)再び低Ca^<2+>でD候補が核に移動、MMP-9分泌の抑制、(3)これまで核内phospho-c-Jun、DNAのfragmentation、TUNEL染色の陽性は検出されず、培養液soluble Fas ligand濃度も有意な変化を認めなかった。4、分化誘導TGF-β、炎症やアポトーシス誘導TNF-α、IL-1αにて、KCで(1)濃度依存的に選択的MMP-9発現誘導、(2)D候補の細胞質への移行傾向を認め、(3)phospho-c-JunをTNF-α、IL-1α刺激後核に検出、(4)Luciferase assayでKRE-M9がTNF-α、IL-1αで高Ca^<2+>と同様MMP-9発現誘導に関わることが判明した。5、RT-PCR法から、APAF-1は以上の刺激でこれまで検出されず、TGF-βやTNF-α刺激によりtissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)-2の発現増加を認めた。7、ultraviolet B照射KCで、(1)強度依存的にMMP-9とインボルクリンとの発現誘導を認め、(2)phospho-c-Junを核に検出、D候補の細胞質への移行傾向を認め、(3)生細胞数の強度依存的減少、annexin V陽性細胞を認めた。8、培養線維芽細胞でもTNF-αやTGF-β刺激でMMP-9分泌誘導を確認した。9、In situザイモグラフ法で有棘細胞癌の腫瘍浸潤部、異常角化部にゼラチン分解活性を検出、MMP阻害剤1,10-phenanthrolineで活性阻害された。結論として、早期アポトーシスにMMP-9が関与、この発現をD候補が抑制することが示唆された。
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