| 研究課題/領域番号 |
13670893
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| 研究機関 | 大分医科大学 |
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研究代表者 |
園田 忠重 大分医科大学, 医学部, 助手 (80244169)
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| 研究分担者 |
佐藤 俊宏 大分医科大学, 医学部, 助手 (70244176)
松尾 哲孝 大分医科大学, 医学部, 助手 (10284788)
吉岡 秀克 大分医科大学, 医学部, 教授 (00222430)
浅田 裕司 大分医科大学, 医学部, 助手 (30284798)
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| キーワード | protease nexin-1 / SERPIN / 毛包 / 毛周期 / 蛋白発現 / モノクローナル抗体 / ポリクローナル抗体 |
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| 研究概要 |
1、Protease nexin-1(PN1)組み換え蛋白の大腸菌発現
Signal peptideを除いたPNl cDNAをpGEXプラスミドにサブクローニングし、PN1発現ベクターを構築した。pN1をGST-PN1融合蛋白として大腸菌で発現させ、Gluthatione-Sepharoseを用いて回収、精製した。精製蛋白がPN1であることをアミノ酸シークエンスで確認した。
2、モノクローナル抗体の作製
上記のGST-PN1蛋白をラットに免疫し、リンパ節からリンパ細胞を調整し、ハイブリドーマを作製した。ELISAとWestern blot法を用いてクローニングを続けたが、結局抗PN1抗体を産生するクローンの確立には至らなかった。現在、さらに精製したGST-PN1融合蛋白を抗原として免疫すること、及びスクリーニング法の改善を検討中である。
3、ポリクローナル抗体の作製
PN1のアミノ酸配列の中で抗原性の高いペプチド領域を予測し、14merの合成ペプチドを合成した。これにKLHを結合させたものを抗原としてウサギに免疫し、抗血清を得た。今後、これを用いて免疫組織化学的検討を行い、毛包におけるPN1蛋白の局在を確認する。また毛周期による変化についても検討予定である。
さらに上記のGST-PN1融合蛋白を抗原として、もしくはPNl cDNAをpETプラスミドにサブクローニングしHis-Tagを持ったPN1を発現させこれを抗原としてウサギに免疫し、ポリクローナル抗体を作製することを計画している。
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