| 研究課題/領域番号 |
13671078
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
血液内科学
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
窓岩 清治 自治医科大学, 医学部, 講師 (70296119)
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| 研究分担者 |
坂田 洋一 自治医科大学, 医学部, 教授 (40129028)
水上 浩明 自治医科大学, 医学部, 助手 (20311938)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| キーワード | 血友病 / 血液凝固第VIII因子 / 遺伝子治療 / SIVウイルスベクター / 造血幹細胞 / 脂肪細胞 / NOD / SCIDマウス / db / dbマウス |
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| 研究概要 |
Simian Immunodeficiency Virus(SIV)ベクターを用いた血友病Aに対する遺伝子治療法の開発を目的とし、SIVウイルスベクターにヒト血液凝固第VIII因子(hFVIII)を発現させるコンストラクトを構築し、標的細胞への導入効率、発現効率を検討するともに、小動物(マウス)生体内でのhFVIIIの活性および抗原の発現について解析した。1)プロモーターの選択:SIVウイルスベクターに組み込むプロモーターを、FVIIIcDNAからB領域をコードする部分を除いたBDD型第VIII因子(BDD-FVIII)cDNAをプラスミドベクターに組み込み、産生されるBDD-FVIII抗原量を指標に検討し、PGK1プロモーターとEF1-αプロモーターにおいて良好な発現量を得た。またSIVウイルスベクターにBDD-FVIIIコンストラクトを搭載し、遺伝子治療の標的細胞として想定される血管内皮、肝、筋細胞、およびCD34陽性細胞での発現を検討したところ、CD34陽性細胞においてEF1-αプロモーターがCMVプロモーターと同等の発現を示した。2)NOD/SCIDマウスを用いた検討:CD34陽性細胞にGFPまたはFVIIIを搭載したSIVベクターをtransfection後、放射線照射を加えたNOD/SCIDマウスに細胞移植を行い、骨髄への生着率と末梢血中のヒトFVIII抗原量を測定した。GFP搭載SIVベクターでtransductionを検討し、MOI1で48時間の感染時間では約50%の細胞がGFP陽性であった。FVIII搭載SIVベクターを遺伝子導入したCD34陽性細胞は、10(6)個・24時間あたり約10microgのFVIIIを産生し、遺伝子治療に対し充分な量であると考えられた。FVIII搭載SIVウイルスベクターを遺伝子導入したCD34陽性細胞のマウス細胞移植モデルでは、移植12週間後の骨髄中にヒトCD45,CD34陽性細胞の3-10%の生着を確認し、蛍光免疫染色法にてFVIII産生細胞を同定できた。同時にヒトCD41細胞をヒトFVIII抗体を用いて検討し、FVIIIが血小板内に蓄積されていることも確認できた。3)肝細胞、脂肪細胞への遺伝子導入の検討:10(8)単位のSIVベクターをマウスに経腸管膜静脈的に投与し、肝組織での発現を検討した。肝細胞にGFPの発現がみられたが、Kupper細胞などの網内系細胞優位にGFPが発現していた。BDD-hFVIII搭載SIVウイルスベクターを培養脂肪細胞NIH3T3-L1に感染させると、10(6)個・24時間あたり320±39.8ngのhFVIIIの産生が得られた。4)db/dbマウスを用いた検討:db/dbマウスの背部皮下脂肪組織に遺伝子導入したところ、第11日目のマウス血漿中に1.8ng/mLのhFVIIIが検出された。遺伝子導入したマウス皮下組織を用いたRT-PCR法により、hFVIII mRNAが検出されるとともに、免疫組織学的にhFVIII抗原を確認できた。
これらの結果は、hFVIII遺伝子搭載SIVベクターを用いた血友病Aに対する遺伝子治療への基盤研究と成り得るものと考えられる。
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