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甲状腺癌では、Ret遺伝子の再配列異常の他に、組織特異的な癌遺伝子は、未だに発見されていない。そこで、甲状腺癌における新たな変異遺伝子の発見を目的として本研究を行なっている。まず、悪性度の高い甲状腺癌手術摘出組織を患者からインフォームドコンセントを得て提供を受け、RNAの抽出を行なった。次に、少量(1μg)のRNAよりSMART法(クローンテック社)を改良した方法で、完全長のcDNAライブラリーを作成した。両端にPCRで増幅可能なプライマーサイトを作成してある。このcDNAライブラリーをレトロウイルス・ベクターに組みこんだ後、NIH3T3細胞に導入し、フォーカス形成能を調べた。この結果、4個のフォーカス形成が見られた。それぞれのフォーカスから細胞を単離してヌードマウスに移植し、腫瘍形成能を確かめた。得られた4クローンともに、2-3週間で腫瘍形成を確認することができた。次いで、マウスに形成した腫瘍からDNAを抽出して、特異的なプライマーを用いることにより、NIH3t3細胞内の染色体に組み込まれたヒト遺伝子の確認作業を行なった。増幅したDNAをシークエンス解析し、Genbankに照合することにより遺伝子の同定を行なった。その結果、1クローンからは、Raf-1遺伝子の5'側の欠損したものであり、他の3クローンからはB-Raf遺伝子の5'側欠損タイプであることがわかった。Raf遺伝子に関しては、5'側が欠損することで、活性型になることがわかっており、引き続きRas-MAPKの活性を増加させ細胞増殖を促進することが示唆された。今後、この得られた遺伝子が甲状腺癌の形成に関与しているかどうかについて検討してゆく予定である。
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