ヒト胸T細胞ネガテイブセレクションにおけるシグナル伝達

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13671399
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 深井 一郎 名古屋市立大学, 医学部, 助手 (10244550)
• 研究分担者: 藤井 義敬 名古屋市立大学, 医学部, 教授 (40156831)
• キーワード: ネガティブセレクション / p53 / シグナル伝達 / TCR

研究概要

1.ヒト胸腺CD4+CD8+DP cellにおけるTCRシグナル解析
(a)DP cellsをmagnet beads法を用い、sortingして以下の刺激を加えた。
(1)抗CD3抗体(10ug)によりcross linkng
(2)抗CD3+28抗体(各10ug)によりdouble cross linkng
(3)dexamethazone(50ug)によるp53非依存性アポトーシス刺激
(4)etoposide(50ug)によるp53依存性アポトーシス刺激
(b)DP cellsのアポトーシス解析
上記の刺激したT細胞のアポトーシスの解析をミトコンドリアの膜電位の低下、AnnexinVの発現、caspase3の活性をフローサイトメトリーにて解析し、kineticsを解明した。
(c)p53リン酸化のkiinetic解析
5分間隔でシグナルをとめ、Ser15 Phosph sepecific anti-p53Ab, Ser20 Phospho specific anti-p53Abでwestern blotを行った。同じmembraneを抗体ストリップしてPhospho non specific Abでre-blotしてリン酸化p53の比率を算出した。
以上の結果よりp53リン酸化およびアポトーシスのkiineticを解析した。