| 研究課題/領域番号 |
13671550
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
吉田 浩二 近畿大学, 医学部, 講師 (60230736)
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| 研究分担者 |
福田 寛二 近畿大学, 医学部, 助教授 (50201744)
仲谷 達也 近畿大学, 医学部, 助手 (40319661)
斉藤 昭夫 近畿大学, 医学部, 講師 (40153788)
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| キーワード | aggrecanase-1 / α_1-antitrypsin / α_1-antichymotrypsin / two-hybrid法 |
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| 研究概要 |
1.aggrecanase-1 cDNAのクローニング
既に報告されているaggrecanase-1 mRNA塩基配列を参考にして、PCRによるクローニングのためのprimerを設計し、ヒト肺線維芽細胞cDNAライブラリーよりaggrecanase-1 cDNAをクローニングした。
2.酵母two-hybrid法によるaggrecanase-1結合タンパク質のスクリーニング
酵母two-hybrid法はタンパク質間相互作用を酵母内で検出する実験系である。
(1)上記のようにクローニングしたヒトaggrecanase-1のcatalytic domainをbaitとした。これとreporter plasmidで酵母EGY48を形質転換し、さらにprey vectorに組み込んだヒト肝臓cDNAライブラリーで形質転換した(一次スクリーニング)。ここで得たクローンをβ-ガラクトシダーゼ活性とLeu要求性を併用して二次スクリーニングを行い、両方のアッセイで陽性になったもののみを最終的な陽性クローンとした。
(2)約2.58×10^6個の形質転換体をスクリーニングし、一次スクリーニングでは75個、二次スクリーニングでは8個の陽性クローンを得た。これらのクローンの塩基配列を解析したところ、3個がα_1-antitrypsin(AT)、2個がα_1-antichymotrypsin(ACT)であった。
(3)aggrecanase-1はAT、ACTと相互作用することが示唆された。ATやACTがaggrecanase-1とin vivoでも結合するか、その場合、aggrecanase-1活性を阻害するかどうか、また、どの部位がaggrecanase-1との結合に関与するかなどを今後検討する予定である。
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