| 研究課題/領域番号 |
13671550
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
吉田 浩二 近畿大学, 医学部, 講師 (60230736)
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| 研究分担者 |
福田 寛二 近畿大学, 医学部, 教授 (50201744)
仲谷 達也 近畿大学, 医学部, 助手 (40319661)
斉藤 昭夫 近畿大学, 医学部, 講師 (40153788)
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| キーワード | aggrecanase-1 / α1-antitrypsin / α1-antichymotrypsin / two-hybrid法 |
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| 研究概要 |
1.aggrecanase-1と相互作用するタンパク質のスクリーニング
酵母two-hybrid法を用いてタンパク質問相互作用を検討した。ヒトaggrecanase-1(Ag-1)のcatalytic domainをbaitとしてヒト肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングし、preyタンパク質としてα1-antitrypsin(AT)、α1-antichymotrypsin(ACT)が得られた。
2.aggrecanase-1とα1-antitrypsinよびα1-antichymotrypsinの相互作用
(1)Ag-1タンパク質全長のC末にFLAG tagを付加したもの(Ag-1FLAG)を培養細胞(COS-7)で強制発現させ、培養上清中に分泌させた。Ag-1FLAGとATおよびACTを免疫沈降法で結合を検討したところ、いずれも共沈しなかった。また、AT、ACTの糖鎖をN-Glycanaseにより酵素的に取り去り、Ag-1との相互作用も免疫沈降法で調べてみたが、結合は見られなかった。
(2)ATおよびACTをニトロセルロース膜に固定し、Ag-1FLAGと反応させイムノブロット法で検討したところ、Ag-1FLAGとATおよびACTはいずれも結合しなかった。
(3)mature Ag-1とmature ATのbait, prey vector constructをそれぞれ作製し、two-hybrid法にて相互作用を検討したが、相互作用は見られなかった。
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