BMP特異型Smadに結合する新規蛋白のスクリーニングと機能解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13671554
• 研究機関: (財)癌研究会
• 研究代表者: 今村 健志 財団法人癌研究会, 癌研究所・生化学部, 主任研究員 (70264421)
• キーワード: BMP / Smad / シグナル伝達

研究概要

骨形成因子(bone morphogenetic proteins : BMPs)のシグナル伝達分子Smadはレセプターの刺激により、細胞質から核に移行し、標的遺伝子の転写活性を調節して機能を発揮することがわかっている。
本研究は、マススペクトロメトリーやマイクロシークエンシング法を用いて、哺乳類細胞内でBMP特異型Smadと結合する蛋白質を微量で分離し、その同定をデータベースなどを用いて迅速に行うことを目的としている。昨年度までに、BMP特異型Smadに結合する新規蛋白のスクリーニングのために、Smad1/5/8のcDNAにFlagやMycなどのエピトープタッグをつけたコンストラクトを作製し、COS細胞においての発現をチェックした。
まず、これらのコンストラクトを、BMPsによって骨芽細胞に分化する哺乳類の細胞株のひとつであるC2Cl2細胞にトランスフェクションし、結合蛋白の回収を試みた。しかし、アガロースビーズなどに結合したFlagやMycなどの抗体を用いて蛋白質を免疫沈降する際の抗体のバックグラウンドが問題となり、マススペクトロメトリーによる解析が難しいことがわかった。
そこで次に、抗体のかわりにSmad結合配列のDNAをプローブに用いた。具体的には、Smad結合配列のDNAをビオチン化し、ストレプトアビジンマグネットにリンクさせ、HeLa細胞の核抽出液と反応させ、DNA結合蛋白質を回収し、マススペクトロメトリーで同定した。その結果、数種類の蛋白質がSmadを介してDNAに結合していることを明らかにした。現在これら結合蛋白質の機能解析を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Tajima, Y.et al.: "Chromosomal Region Maintenance 1(CRM1)-dependent Nuclear Export of Smad Ubiquitin Regulatory Factor 1(Smurf1) Is Essential for Negative Regulation of Transforming Growth Factor-beta Signaling by Smad7"J Biol Chem. 278. 10716-10721 (2003)
• [文献書誌] Midorikawa, Y.et al.: "Glypican-3, overexpressed in hepatocellular carcinoma, modulates FGF2 and BMP-7 signaling"Int J Cancer. 103. 455-465 (2003)
• [文献書誌] Mizuide, M.et al.: "Two short segments of Smad3 are important for specific interaction of Smad3 with c-Ski and SnoN"J Biol Chem. 278. 531-536 (2003)
• [文献書誌] Nishihara, A.et al.: "Functional Heterogeneity of Bone Morphogenetic Protein Receptor-II Mutants Found in Patients with Primary Pulmonary Hypertension"Mol Biol Cell. 13. 3055-3063 (2002)
• [文献書誌] Suzuki, C.et al.: "Smurf1 regulates the inhibitory activity of Smad7 by targeting Smad7 to the plasma membrane"J Biol Chem. 277. 39919-39925 (2002)