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本研究の目的は培養血管内皮細胞を用い、内皮細胞内カルシウムイオン濃度([Ca^<2+>]_i)とNO産生量を同時測定することにより、レセプター及び非レセプター刺激時のNO合成酵素(NOS)のCa^<2+>感受性の変化を明らかにすることである。研究成果の概要は以下の通りである。
1)カルシウム蛍光指示薬であるFura2・AM(5μM)を負荷した培養ウシ大動脈内皮細胞を倒立型蛍光顕微鏡下に観察した。2波長蛍光光度計を用い、340及び380nmの波長励起による510nm蛍光強度(F340及びF380)を記録し、F340とF380の比を[Ca^<2+>]_iの指標とした。
2)レセプター刺激薬であるブラジキニン(10nM)によりF340/F380で示された[Ca^<2+>]_iは一過性の急速な上昇とそれに続く持続相の二相性の反応がみられた。最初の一過性の上昇は内皮細胞内カルシウム貯蔵部位からのCa^<2+>の遊離によるものであり、持続相は細胞外Ca^<2+>流入によると考えられた。これに対し、レセプターを介さずに細胞膜のCa^<2+>透過性を亢進させるA23187(100nM)による[Ca^<2+>]_i上昇は一相性であり、持続相のみがみられた。
3)静脈麻酔薬であるケタミン(100μM)、エトミデイト(100μM)はブラジキニンによる[Ca^<2+>_i上昇を抑制した。この抑制は一過性の急速相と持続相双方でみられた。しかし、これら麻酔薬はA23187による[Ca^<2+>]_i上昇には何の影響も与えなかった。
4)静脈麻酔薬はレセプター刺激による[Ca^<2+>]_i上昇を特異的に抑制することにより、内皮依存性弛緩反応を抑制することが明らかとなった。
現在はNO蛍光色素であるDAF-FM DAを用いて培養内皮細胞のNO産生を定量中であり、[Ca^<2+>]_i測定の結果と合わせることにより、レセプター及び非レセプター刺激時のNO合成酵素(NOS)のCa^<2+>感受性の変化とそれに及ぼす麻酔薬の影響を明らかにする予定である。
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