先天性無神経節腸管における神経堤幹細胞移植による消化管神経叢の再生分化誘導

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13671870
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 下竹 孝志 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (90254341)
• キーワード: ヒルシュスプルング病 / 消化管神経叢 / 発生学 / 分化誘導

研究概要

先天性無神経節症および正常型ラット胎仔の作成と子宮からの摘出/S1系及び1s系heterozygotesラットおよびの繁殖コロニーを樹立し、予定交配によりhomozygotes胎仔を作成した。一方、正常型ラットとしてSprague-Dawley系ラットを交配させ、膣栓の存在をもって妊娠を確認し、各系統の妊娠ラット子宮から胎生14.0〜17.5の各日齢にて、実体顕微鏡下(Nikon model SMZ-U,×20〜75)にmicro-manipulatorを用いて清潔環境下に胎仔を採取した。
ラット胎仔からの神経堤幹細胞の単離・純化と培養/摘出した各系統のラット胎仔を開腹の上、両側坐骨神経を摘出し直ちに10mM HEPES含有のCa, Mg-free冷却HBSS液に入れ、続いて摘出した神経束を0.025%trypsin及び1mg/mL濃度のcollagenase存在下に37℃にて4分間処理し、1mg/mL牛胎仔血清(bovine serum protein)含有L15培養液にてincubationした。細胞分離培養液を抗p75抗体および抗p0抗体にて蛍光免疫染色の上、蛍光フローサイトメーター(dual laser flow cytometer ; FACS)にてp75+p0-分画細胞を分離(cell sorting)を試みた。
その結果、当実験系における消化管神経叢の発生は再現性をもってヒルシュスプルング病と同様の病態学的共通性を有しており、ヒトにおけるヒルシュスプルング病の病態ないし発生治療学的アプローチの可能性が明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Bitoh Y, Shimotake T, Sasaki Y, et al.: "Development of the pelvic floor muscles of murine embryos with anorectal malformations"Journal of Pediatric Surgery. 37(2). 224-227 (2002)
• [文献書誌] Bitoh Y, Shimotake T, Kubota Y, et al.: "Impaired distribution of retinoic acid receptors in the hindgut-tailgut region of murine embryos with anorectal malformations"Journal of Pediatric Surgery. 36(2). 377-380 (2001)
• [文献書誌] Tomiyama H, Shimotake T, Ono S, et al.: "Relationship between the type of RET/GDNF/NTN or SOX10 gene mutations and long-term results after surgery fortotal colonic aganglionosis with small bowel involvement"Journal of Pediatric Surgery. 36(11). 1685-1688 (2001)
• [文献書誌] Shimotake T, Go S, Tomiyama H, et al.: "Proximal jejunostomy with or without myectomy-myotomy modification in 5 infants with total intestinal aganglionosis-an experience of surgical treatments in a single institution-"Journal of Pediatric Surgery. (in press). (2002)
• [文献書誌] Shimotake T., Go S., Inoue K., et al.: "A homozygous missense mutation in the tyrosine kinase domain of the RET proto-oncogene in an infant with total intestinal aganglionosis"American Journal of Gastroenterology. 96(4). 1286-1291 (2001)
• [文献書誌] Inoue K, Shimotake T, Tomiyama H, et al.: "Mutational analysis of the RET and GDNF genes in children with hypoganglionosis"European Journal of Pediatric Surgery. 11(2). 120-123 (2001)