| 研究概要 |
分化した骨芽細胞としてMC3T3細胞、未分化間葉細胞としてC3H10T1/2細胞を培養し,それらの細胞からtotal RNAを抽出した.これらのRNAをショ糖密度勾配遠心法によるポリゾーム解析を行い,リボゾームとの結合の多い画分ならびに結合の少ない画分を得た.それらのRNAを電気泳動後,種々のプローブを用いNorthern Blot法,ドットブロット法を行った.また,様々なプライマーを用いた定量的RT-PCR法を行ない,細胞の分化程度の違いによりリポゾームとの結合性の変化するすなわち翻訳活性の変動するmRNAを検索した.オステオカルシンmRNAは,骨芽細胞分化に伴ってリポゾームの結合が有意に増加した.また,periostin等の細胞接着因子のmRNAについても,細胞の分化程度によって翻訳活性の変化が認められた.
次に,これらの翻訳制御に係わる領域を同定するために,ヒトperiostin遺伝子を用いて,転写開始点以降の種々の長さの5'非翻訳領域ならびに3'非翻訳領域を含んだ5種類のルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した.これらのプラスミドをカチオニックリポソームによる方法でMC3T3細胞にトランスフェクトし,それぞれのmRNAを細胞内で合成させレポーターとしてルシフェラーゼタンパク質を合成させた.細胞を分化させて培養後,細胞を回収し,ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性をdual法にて測定した.ヒトperiostin遺伝子の5'非翻訳領域を含むレポータープラスミドを導入した細胞において、骨芽細胞分化により特異的にルシフェラーゼ活性が上昇した.また,5'非翻訳領域RNAをプローブとして用いたRNAゲルシフトアッセイを行うと,骨芽細胞分化に伴ってバンドシフトが認められ,数種類のRNA結合タンパク質がこの領域に結合し翻訳活性を制御していることを示唆する結果が得られた.
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