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1.臍帯静脈血由来血管内皮細胞(HUVEC)の分離:臍帯静脈を通法に従い、コラゲナーゼ処理し、細胞浮遊液からHUVECを分離した。
2.HUVECとPB-PMNsの共培養:HUVECを血管内皮細胞専用液体培地中で、37℃、CO_2インキュベーターにて細胞培養した。2代継代培養を行ったのち、コンフルエントになったHUVEC上にPB-PMNsを播種し、共培養を行った。その際、Porphyromonas gingivalis由来LPS、IL-1およびインターフェロンγで刺激した。培養終了後、培養液を回収したのちHUVECをFBS添加EDTA液でカルチャープレートから浮遊させ、浮遊細胞の回収を行った。
3.NO濃度の測定:通法に従い、培養液中のNitrite濃度を測定した。すなわち、培養液と同量のGriess試薬を加え、10分間反応させたのち、波長540nmにて吸光度を測定した。その際、亜硝酸ナトリウムを希釈したものを用いて同様に反応させ、検量線を作成することで、NO濃度の算定を行った。その結果、NO濃度は32.2±7.2μMであった。
4.免疫組織学的検索:通法に従い、抗ヒトiNOS抗血清を用いたABC法を行い、HUVECのiNOS産生を免疫組織学的に検索した。すなわち、HUVECに抗ヒトiNOS抗血清を反応させたのち、アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体を反応させ、発色させたのち光学顕微鏡で鏡検した。その結果、血管内皮細胞のiNOS産生を確認した。
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