| 研究概要 |
前年度の研究によりラットの下顎頭骨折モデルが確立されたことから,次に遺伝子導入の条件設定を行った.非ウイルス性のHVJ-リポソーム法がアデノウイルスベクター法に比較し,将来的に臨床応用が可能と考えられることから,HVJ-リポゾーム法を用いて遺伝子導入を検討することとした.ラット下顎頭骨折モデルにおけるHVJ-リポゾーム法の至適条件を検索するため,以下の実験を行った.
1)in vitroラット骨髄から採取した未分化間葉細胞に対して,ルシフェラーゼ遺伝子を導入し,ルミノメーターにて計測し,導入効率について検討した.
2)in vivoラット下顎頭を骨折させβ-galactosidase遺伝子(LacZ)をHVJ-リポソーム法にて遺伝子導入した.導入3日後に灌流固定後,X-ga1染色し導入効率を検討した.脱灰後,薄切切片を作製し,β-galactosidase抗体を用いて免疫染色を行い,遺伝子導入の検討した.
これらの結果からHVJ-リポソーム法を用いた遺伝子導入が,下顎頭骨折モデルに応用可能であることが確認された.現在,HVJ-リポソーム法を用いてCTGFの遺伝子導入を試みている.CTGF発現効果を検討するために,導入後1,3,5,8週間後に下顎骨を取り出し,anti-CTGF抗体によってin situ hybridization,免疫組織化学的にCTGFの発現と局在を確認する.CTGF, Collagen type I, II, IIIX, Cbfa1, TGFβの発現をin situ hybridization検討する.また骨形態計測により骨のリモデリングを検討し,治療効果を評価する.
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